p40是白细胞介素-12(Interleukin-12,IL-12)与IL-23的共用亚基,除了能与p35或p19以异源二聚体的形式组成IL-12或IL-23,还可以以单体和同源二聚体的形式发挥免疫作用。目前,在哺乳动物中只发现一种p40编码基因,而在多个硬骨鱼中分离鉴定出三种p40编码基因,即p40a、p40b和p40c,这是由鱼类特有的全基因组复制事件导致的。哺乳动物中最初发现p40同源二聚体的功能是能拮抗IL-12/23的作用,参与某些自身免疫疾病的调控;后来发现其也能通过诱导NO的产生,继而抑制调节性T细胞的产生。但是在硬骨鱼中,目前关于p40同源二聚体的功能还未知。本论文以草鱼为研究模型,以重组草鱼p40a、p40b和p40c同源二聚体蛋白为工具,探究草鱼p40a、p40b和p40c同源二聚体发挥的免疫效应。本课题通过大肠杆菌原核表达系统和变复性方法获得重组草鱼p40a、p40b和p40c同源二聚体蛋白,以草鱼头肾白细胞(Head kidney leukocytes,HKLs)为细胞模型,验证获得的重组蛋白的生物学活性,结果显示三种重组蛋白都能剂量依赖性上调TNF-α和IL-1β的基因表达和蛋白分泌,证明了获得的三种重组蛋白的生物学活性。为验证这些异构体是否保留其哺乳动物同系物的功能,用重组草鱼p40a、p40b和p40c同源二聚体蛋白分别和草鱼IL-23A、IL-23B和IL-23C联合处理HKLs,但是没有发现p40二聚体蛋白拮抗IL-23的活性,它们实际进一步上调IL-17A/F1的基因表达水平。事实上,单独的重组草鱼p40a、p40b和p40c同源二聚体蛋白就可以上调HKLs中IL-17A/F1的基因表达。鉴于已知IL-1β放大IL-23对IL-17A/F1基因表达的上调,课题进而检测了p40同源二聚体是否通过诱导IL-1β参与IL-17A/F1的基因表达,因此设计了IL-1β免疫中和实验,结果显示anti-IL-1β并不能抑制p40同源二聚体与IL-23的联合作用,表明草鱼p40同源二聚体放大IL-23的作用与IL-1β的产生无关。进一步的信号通路机制研究显示,p40同源二聚体能够增强IL-23刺激的STAT3磷酸化水平,表明草鱼p40同源二聚体与IL-23的联合作用放大了下游的信号通路。在哺乳动物中,p40同源二聚体的另一重要功能是能诱导iNOS的表达,为了探究草鱼p40同源二聚体是否具有这个功能,使用获得的三种重组草鱼p40同源二聚体蛋白处理HKLs,结果显示三种重组草鱼p40同源二聚体蛋白都能剂量依赖性上调iNOS的基因表达。相反地,草鱼p40单体不能诱导iNOS的表达,提示草鱼p40单体和同源二聚体存在功能差异。为此开展相关机制研究,通过草鱼iNOS的启动子序列分析发现参与调控iNOS表达的转录因子主要为STAT3和NF-κB,因此分别使用STAT3抑制剂和NF-κB抑制剂与三种p40同源二聚体共处理HKLs,发现它们都能抑制p40同源二聚体对iNOS的上调,揭示了STAT3和NF-κB信号通路的参与。另外,在哺乳动物中,IRF1是iNOS表达不可缺少的转录因子,通过检测草鱼p40单体和同源二聚体对IRF1表达的影响,结果显示p40同源二聚体而非单体上调IRF1的表达,这可能是草鱼p40单体和同源二聚体对iNOS表达的差异调控的原因。本论文首次获得了重组草鱼p40a、p40b和p40c同源二聚体蛋白,并初步鉴定了其免疫学功能,为探究草鱼p40a、p40b和p40c同源二聚体在硬骨鱼中的免疫学地位奠定了基础。