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目的探讨细胞表面GRP78和CRAF相互作用情况,确定GRP78和CRAF在肝癌细胞对索拉非尼耐药性形成中的作用及机制,根据肿瘤细胞表面GRP78和CRAF表达的不同,采取差异性的治疗方案,为肝细胞癌的个性化治疗提供选择方案的潜在标志物。方法选择对索拉非尼敏感的人肝癌细胞系Hep G2为研究对象,进行下列研究:1.建立获得性耐药的细胞模型,在细胞水平对耐药性细胞系进行鉴定。显微镜下观察比较Hep G2和HepG2-SR两种细胞的形态差异;通过体外侵袭实验检测HepG2-SR细胞的侵袭能力。用不同浓度的索拉非尼(0,1,5,10μΜ)的处理HepG2-SR细胞,应用MTT和克隆形成实验检测其对索拉非尼的反应性;流式细胞术检测索拉非尼对HepG2-SR细胞凋亡的影响;免疫印迹检测HepG2-SR细胞中CRAF的表达。2.GRP78和CRAF在肝细胞癌索拉非尼耐药性形成中的作用。检测HepG2-SR细胞中GRP78和CRAF的表达水平,在HepG2-SR细胞中用sh RNA分别下调GRP78和CRAF,通过MTT法检测索拉非尼对HepG2-SR细胞体外增殖的影响;体外克隆形成实验检测索拉非尼对HepG2-SR细胞克隆形成能力的影响。3.证实HepG2-SR细胞表面GRP78和CRAF之间存在相互作用。通过在HepG2-SR细胞中共转入p EGFP-N1-GRP78、p Ds Red-CRAF两种质粒,共聚焦显微镜技术证实GRP78和CRAF在细胞中存在共定位;分离并提取HepG2-SR细胞膜蛋白,用GST-pulldown实验检测HepG2-SR细胞膜提取物中GRP78和CRAF在体外存在直接相互作用;免疫共沉淀实验检测GRP78和CRAF在细胞内存在相互作用。结果1.HepG2-SR细胞为索拉非尼耐药细胞,可用于后续实验。体外侵袭实验结果显示,HepG2-SR细胞的侵袭性更强。用索拉非尼(0,1,5,10μΜ)处理Hep G2和HepG2-SR,克隆形成实验结果显示,HepG2-SR细胞的克隆形成能力高于其对应的肝癌细胞Hep G2;MTT实验结果显示,HepG2-SR细胞的体外增殖能力强于Hep G2;流式细胞术结果显示,HepG2-SR抵抗凋亡的能力比Hep G2强;免疫印迹结果显示,在一定的浓度范围内,Hep G2细胞中CRAF的表达与索拉非尼的作用浓度呈负相关,而HepG2-SR细胞中CRAF的表达没有变化。2.GRP78和CRAF的高表达均能增加肝癌细胞对索拉非尼的耐药性。Western实验结果显示,HepG2-SR细胞中GRP78和CRAF均高表达。用sh RNA的方法分别下调HepG2-SR细胞中GRP78和CRAF,再用索拉非尼(0,1,5,10μΜ)的处理,MTT实验结果显示,HepG2-SR细胞的克隆形成能力与对照组比较明显减弱;用5μΜ索拉非尼处理,克隆形成实验结果显示,HepG2-SR的克隆形成能力与对照组比较明显减弱。3.HepG2-SR细胞表面GRP78和CRAF存在相互作用。HepG2-SR细胞中共转入p EGFP-N1-GRP78、p Ds Red-CRAF两种质粒,共聚焦显微镜下观察,GRP78和CRAF共表达于HepG2-SR细胞表面和胞浆中,且细胞表面明显多于胞浆。GST-pulldown实验结果显示,GRP78和CRAF体外存在直接作用。免疫共沉淀实验结果显示,GRP78和CRAF在细胞内存在相互作用。结论1.GRP78和CRAF的高表达均能促进肝癌细胞对索拉非尼的耐药。2.HepG2-SR细胞表面GRP78和CRAF存在相互作用。