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目的:由于缺血性脑卒中的高发病率、高致残率和高死亡率,以及目前溶栓治疗的局限性,寻求时间窗以外的脑保护治疗格外重要。研究表明,在脑缺血再灌注损伤后,Notch1信号通路上调参与损伤后的炎症反应,而Botch蛋白可结合并阻断Notch1的成熟和活化。本项研究旨在探讨Botch蛋白通过拮抗Notch信号通路介导的神经炎症在大脑缺血再灌注损伤(Ischemia/reperfusion,I/R)中的作用及可能机制。方法:体内实验部分,采用大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)的方法制备大鼠缺血再灌注损伤(Ischemia/reperfusion,I/R)模型。首先采用蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测I/R损伤后不同时间点Botch蛋白及Notch1蛋白的活化形式NICD(Notch1 Intercellular Domain)的表达水平,并采用免疫荧光染色(immunofluorescentstaining,IF)技术检测Botch蛋白的细胞定位情况,确定蛋白水平变化最为明显的时间点。将Sprague-Dawley(SD)大鼠分为以下六组:假手术(sham)组、MCAO/R组、MCAO/R+CtrSiRNA(干扰对照)组、MCAO/R+SiRNA-Botch(干扰)组、MCAO/R+Vector(过表达对照)组、MCAO/R+Over-Botch(过表达)组。用蛋白免疫印迹法检测各组干预情况后,行MCAO造模,观察以下指标:1)分别在造模后第0、1、3、7和14天进行转轮实验(Rotarod test)和贴纸去除实验(Adhesive-removaltest)等行为学测试,并记录数据及统计。2)分别在造模后的24h进行神经功能评分。3)采用Fluoro-Jade B(FJB)染色实验检测神经元凋亡情况。4)采用TTC染色法分析梗死体积。5)采用免疫荧光染色技术观察损伤半球小胶质细胞的激活和浸润情况。6)采用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)实验检测大鼠血清中炎症因子IL-6和TNF-α的水平。7)采用WB检测大鼠体内Botch与NICD的变化水平及与Notchl的关系。在体外实验部分,模拟体内I/R模型,构建体外氧糖剥夺/复糖复氧(Oxygen-glucosedeprivation/reoxygenation,OGD/R)模型后,用 WB 检测体外 I/R 损伤后不同时间点Botch蛋白及NICD的表达水平,确定蛋白水平变化最为明显的时间点,将提取的原代神经元细胞或原代小胶质细胞分为以下六组:Normal(对照)组,OGD/R组,OGD/R+CtrSiRNA(干扰对照)组,OGD/R+SiRNA-Botch(干扰)组,OGD/R+Vector(过表达对照)组,OGD/R+Over-Botch(过表达)。用WB检测各组干预Botch后,以下指标的改变:1)利用ELISA实验检测大鼠原代小胶质细胞上清中炎症因子IL-6和TNF-α的水平。2)采用WB检测原代神经元细胞中Botch与NICD的变化水平及与Notch1的关系。3)采用共聚焦免疫荧光染色技术检测NICD在亚细胞器线粒体的定位情况。4)使用荧光酶标仪采用MitoSox技术检测NICD向线粒体易位的过程刺激线粒体内的活性氧(mtROS)的积累情况。结果:(1)体内实验部分,在大鼠进行MCAO/R建模后,Botch蛋白的表达水平在MCAO/R后6h显著升高,并在MCAO/R后48 h达到峰值。体外实验部分,在对培养的原代神经元进行OGD/R造模后,Botch蛋白的表达水平在12 h时也显着增加,并在12-24 h达到峰值。(2)从表达情况看,Botch表达于NeuN+神经元和Iba1+小胶质细胞,但是不表达于GFAP+星形胶质细胞。(3)通过FJB染色证实,siRNA-Botch组和CtrSiRNA组相比,Botch蛋白敲低后增加了神经元死亡。(4)通过TTC染色发现,Botch蛋白下调后导致局部缺血体积增大,而过度表达Botch则降低了脑组织缺血体积。(5)通过转轮实验,贴纸实验和神经行为评分证明了 Botch改善SD大鼠缺血性卒中后的神经功能。(6)在缺血性脑卒中后,小胶质细胞(Iba1+)被激活,并呈簇状分布。而Botch蛋白上调后减少了激活的小胶质细胞的数量,下调后增加了小胶质细胞的激活。(7)体内、外实验中,ELISA实验显示Botch的上调降低了 MCAO/R后促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平,而Botch的下调导致促炎细胞因子产生水平升高。(8)体内外实验都表明了在I/R损伤后NICD的表达升高,且Botch蛋白下调会增加NICD的产生,过表达Botch会减少NICD的产生。(9)免疫荧光染色共聚焦显微镜观察结果显示,NICD在OGD/R后易位至神经元和小胶质细胞的线粒体。(10)使用荧光酶标仪检测过氧化物的积累情况,发现当Botch过表达时,神经元中超氧化物的积累显著减少,而下调Botch后则导致超氧化物的积累增加。结论:(1)Botch蛋白在缺血损伤后表达增加。(2)Botch蛋白在SD大鼠的MCAO/R模型发挥神经保护作用。(3)Botch蛋白减轻了 I/R损伤后小胶质细胞浸润和神经炎症。(4)Botch蛋白可拮抗Notch1信号通路的激活。(5)Botch蛋白可通过抑制NICD的核转移,减轻I/R损伤后的神经炎症和线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mtROS)的积聚。