多药耐药或多药抗性（multidrug resistance,MDR）系指肿瘤细胞对结构和作用靶点不同的多种化疗药物有交叉耐药性,为化疗失败主要原因之一。三氧化二砷（AS₂O₃）能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡,只杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞,对急性早幼粒细胞性白血病,其它类型的白血病以及许多恶性肿瘤都有良好的疗效。AS₂O₃是一种细胞原浆毒,与含琉基蛋白结合后,可抑制蛋白活性,干扰蛋白的正常结构和功能,因此在对肿瘤多药耐药细胞作用过程中,AS₂O₃可抑制膜转运蛋白功能,阻止药物外排,诱导耐药细胞凋亡,从而逆转其耐药性。MAPK通路是连接细胞外刺激和细胞内基因表达的桥梁,在肿瘤化疗耐药中发挥着重要作用。其中,细胞外信号调节激酶（extracellular regulated Kinase,ERK）是经典的MAPK通路,包括ERK1（P44）和ERK2（P42）,可以被生长因子激活,促进细胞的生长和增殖,目前大多数研究表明,ERK信号通路的过度激活,与许多肿瘤的化疗的耐药存在明显的正相关。因此研究ERK信号通路在AS₂O₃诱导耐药细胞凋亡的过程中的作用,为难治、复发及耐药的白血病患者的临床治疗提供理论和实验依据。实验目的:通过检测抑制细胞外信号调节激酶（ERK）对三氧化二砷（AS₂O₃）诱导人白血病多药耐药细胞株K562/A02细胞凋亡效应有无影响,探讨ERK信号通路在AS₂O₃诱导白血病多药耐药细胞凋亡的信号转导途径中的作用。实验方法:实验前两周将K562/A02细胞置于无阿霉素（Adriamycin,ADM）的培养基中培养,取对数生长期的K562细胞和K562/A02细胞用于实验。以K562细胞为对照组（K562细胞+ DMSO）,K562/A02细胞为实验组。实验组分为空白对照组（K562/A02细胞+DMSO）、单用AS₂O₃组（K562/A02细胞+DMSO+AS₂O₃）、单用ERK抑制剂组（K562/A02细胞+U0126）、AS₂O₃与ERK抑制剂合用组（K562/A02细胞+ AS₂O₃+U0126）。应用噻唑蓝（MTT）比色法、普通光镜和流式细胞术（FCM）检测各组细胞凋亡的效应和细胞周期分布的情况;逆转录聚合酶链反应（RT -PCR）方法检测mdrl,Survivin和caspase-3 mRNA的表达;Western-blot法检测ERK1/2、磷酸化ERK1/2及Survivin蛋白的表达变化情况。实验结果:MTT结果显示:AS₂O₃可抑制K562/A02细胞增殖,呈浓度依赖性和时间依赖性（R24h=0.81,R48h=0.86,R72h=0.90,P<0.01）;单用ERK抑制剂也可抑制K562/A02细胞增殖,但作用不明显,且无浓度依赖性和时间依赖性;二者合用细胞生长抑制率显著增加。细胞周期分析示:单用AS₂O₃组诱导细胞发生G2/M期,合用组发生G0/G1期阻滞（P<0.05）;annexin-Ⅴ法测细胞凋亡结果提示:AS₂O₃+ERK抑制剂组凋亡率显著高于空白对照组、单用AS₂O₃组、单用ERK抑制剂组及单用AS₂O₃组和单用ERK抑制剂组的凋亡率之和（P<0.05）。RT-PCR结果显示: 5μmol/L AS₂O₃作用48h后,mdr1和Survivin mRNA水平降低,caspase 3 mRNA水平升高。单用ERK抑制剂组,mdr1和Survivin mRNA水平降低,而caspase-3 mRNA水平无显著变化。合用组较空白对照组、单用AS₂O₃组、单用ERK抑制剂组,mdr1和Survivin mRNA水平显著降低,caspase 3 mRNA水平显著升高。weatern-blot结果显示:各实验组总的ERK表达水平无明显变化,而磷酸化ERK水平,单用AS₂O₃组较空白对照组略有增高,而单用抑制剂组较空白对照显著降低,合用组较空白对照、单用抑制剂组均显著降低。合用组Survivin蛋白表达水平显著降低。实验结论:1.AS₂O₃以时间-剂量依赖方式抑制K562/A02细胞增殖,并且诱导凋亡,诱导K562/A02细胞G2/M期细胞周期阻滞,下调耐药细胞mdr1和Survivin表达活化caspase-3,启动了细胞凋亡过程,但同时却激活了ERK1/2信号通路。2.单独应用U0126可抑制K562/A02细胞增殖,显著抑制ERK1/2信号通路的活性,诱导细胞发生G1/G0期阻滞;下调耐药细胞mdr1和Survivin表达。但无明显诱导凋亡的作用。3.AS₂O₃与ERK抑制剂合用可协同抑制K562/A02细胞增殖并诱导其凋亡,诱导细胞发生G1/G0期阻滞,协同下调耐药细胞mdr1和Survivin表达并活化caspase-3。提示ERK1/2通路可能参与了AS₂O₃诱导K562/A02细胞的凋亡的过程并发挥重要作用,抑制该通路可增强AS₂O₃诱导耐药细胞凋亡的敏感性。