基于我室改良的骨癌痛模型表明，脊髓P2X4特异性存在于小胶质细胞表面，且其参与骨癌痛大鼠痛觉过敏的形成。此外，近年来研究表明，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经元-胶质细胞间"对话"的重要信号分子，这一神经痛后异常分泌的BDNF是由小胶质细胞上P2X4激活实现的。作为与神经痛相似又有其独特性的疼痛，骨癌痛状态下尚未发现存在类似BDNF介导的改变。据此，我们推测，脊髓小胶质细胞P2X4受体激活介导的BDNF释放可能参与骨癌痛痛敏的发生。本研究将结合在体、离体实验，采用siRNA、行为学，real-time PCR，Western Blot，ELISA，免疫组化等方法，通过分子水平（P2X4受体和BDNF）、细胞水平（小胶质细胞和神经元）以及整体水平（免疫和感觉系统）的"对话"来初探疼痛的神经免疫机制。目的和方法探讨脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在大鼠骨癌痛发生中的作用及其神经免疫机制。应用Walker256乳腺癌细胞种植于大鼠一侧胫骨髓腔，建立骨癌痛模型，并通过疼痛行为学、影像学、病理组织学等评估肿瘤及疼痛发生发展情况；以下按照下述研究目的进行相应的实验分组，并分别采用疼痛行为学（n=10），Western blot（sn=4），Real-time PCR（n=4），免疫组织化学（n=4），小RNA干扰（small interfering RNA，siRNA，n=4)技术以及磺基罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)方法（n=6）进行研究：①观察骨癌痛大鼠脊髓及背根神经节（DRG）BDNF表达产物的变化；②观察小胶质细胞抑制剂米络环素对骨癌痛大鼠脊髓BDNF表达的调节作用及其镇痛效应；③研究BDNF中和抗体对大鼠骨癌痛的镇痛效应及其下游磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2（phosphorylation ofextracellular signal-regulated protein kinase1/2，p-ERK1/2）机制；④针对小胶质细胞上BDNF表达的siRNA筛选及转染复合物的毒性检测；⑤观察BDNFsiRNA对骨癌痛大鼠的镇痛效应及其可能机制。结果①骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角和DRG的BDNF mRNA及蛋白表达均增加，且峰值在造模后第6天(n=4， P <0.01)；②早期（造模后第4～6天连续注射）鞘内注射米诺环素可明显减缓大鼠骨癌痛（机械撤爪阈值PWT及行走评分ambulatory scores）(n=10， P<0.01)；并减缓骨癌痛大鼠脊髓后角的OX-42（小胶质细胞激活标志物）和BDNF的表达；而晚期给药（造模后第10～12天连续注射）则无显著作用；荧光免疫组化显示，造模后第6天，骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角OX-42表达上调；且OX-42/BDNF双标产物也上调。③鞘内注射BDNF中和抗体减缓骨癌痛大鼠机械痛敏(机械撤爪阈值PWT)(n=10， P<0.01)；并显著减少脊髓BDNF和p-ERK1/2的蛋白表达(n=4，均P<0.01)；④LipofectamineTM20008μl复合100nmol siRNA（脂质体与siRNA比例为1：3），不仅细胞毒性低而且转染效率高（n=6，P<0.01），为最佳转染条件；与阴性对照组及siRNA283、siRNA232相比，BDNF siRNA1588（100nmol，脂质体与siRNA比例1：3）干扰小胶质细胞后，其mRNA和蛋白的相对表达量最低（n=6，P<0.01）。⑤与对照组相比，早期（造模后第4～6天连续注射）鞘内注射BDNF siRNA可明显减缓大鼠骨癌痛（机械撤爪阈值PWT及行走评分ambulatory scores）；而晚期给药（造模后第10～12天连续注射）也有镇痛作用，但是没有早期给药明显；单次给药后镇痛持续约24h，高峰在约4h左右；鞘内注射外源性BDNF的致痛作用可能通过BDNF-trkB途径介导。结论BDNF可能与其受体trkB结合后，通过下游的MAPK/ERK1/2途径参与大鼠骨癌痛的发生和维持。目的和方法探讨脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是否可以通过调控神经元N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate， NMDA)受体功能参与大鼠骨癌痛的发展。建立大鼠骨癌痛模型，并按照下述研究目的进行相应的实验分组，分别采用疼痛行为学（n=8），Real-time PCR（n=4），免疫组织化学（n=4）及小RNA干扰（small interfering RNA，siRNA，n=4)技术进行以下研究：①观察骨癌痛大鼠脊髓及背根神经节（DRG）磷酸化的NMDA受体亚型NR1（p-NR1）表达产物的变化；②观察鞘内注射BDNFsiRNA对骨癌痛大鼠脊髓及背根神经节（DRG）BDNF及p-NR1表达的调节作用及其镇痛效应；③观察BDNF是否通过TrkB受体调控NMDA受体功能。结果①骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角和DRG的p-NR1mRNA及蛋白表达均增加，且峰值在造模后第9天(n=4， P <0.01)；②与对照组相比，造模后第9天，鞘内注射BDNF siRNA（造模后第4～6天连续注射）可明显减少骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角和DRG的BDNF和NR1mRNA表达，并减少p-NR1蛋白表达(n=4，P<0.01)；③正常大鼠鞘内注射NMDA可诱发痛行为反应，持续155s (n=8，P <0.01)；BDNF受体trkB的中和抗体trkB-IgG预注射可明显减缓NMDA诱发的痛行为反应(n=8，P <0.01)；而BDNF则可增强该NMDA诱发的痛行为反应。结论BDNF可能与其受体trkB结合后，通过调控神经元NMDA受体功能参与大鼠骨癌痛的发展。目的和方法探讨小胶质细胞上P2X4受体（P2X4R）激活是否可以介导脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的释放及参与大鼠骨癌痛的发生。体外培养大鼠小胶质细胞，并建立大鼠骨癌痛模型，按照下述研究目的进行相应的实验分组，分别采用疼痛行为学（n=10），Western blots（n=4）， Real-time PCR（n=4），免疫组织化学（n=4）及ELISA方法（n=4）进行以下研究：①针对小胶质细胞上P2X4R表达的siRNA体外筛选；②观察体外小胶质细胞上P2X4R的激活是否可以通过P38MAPK机制介导BDNF的分泌和释放；③观察骨癌痛大鼠脊髓P2X4R、磷酸化的p38MAPK(p-p38)表达变化；P2X4R/p-p38、P2X4R/BDNF共表达及BDNF、TNFα、IL-1β分泌的变化；④观察鞘内注射P2X4siRNA对骨癌痛大鼠P2X4R、p-p38表达及BDNF、TNFα、IL-1β分泌的调节作用及其镇痛效应。结果①与对照组相比，转染后24h，小胶质细胞P2X4R mRNA表达明显减少；转染后48h，P2X4R蛋白表达也较对照组明显减少(n=4，P <0.01)；②ATP可能可以通过p38的激活，介导体外培养小胶质细胞的BDNF合成和释放，且该作用在ATP刺激后60min达到高峰(n=4，P <0.01)，并依赖于P2X4R；③骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角的P2X4R蛋白和mRNA表达均增加，且呈现进行性增加趋势，峰值在造模后第18天(n=4，P<0.01)；骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角的p-p38蛋白表达，以及BDNF， TNFα和IL-1β的分泌均明显增加，且峰值在造模后第6天(n=4，P <0.01)；荧光双标免疫组化显示，造模后第6天，骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角P2X4R/BDNF和P2X4R/p-p38双标产物均明显上调；④与对照组相比，造模后鞘内注射P2X4R siRNA(第4～6天连续注射）可明显减缓大鼠骨癌痛（机械撤爪阈值PWT及行走评分ambulatory scores）(n=10，P <0.01)；并可明显减少骨癌痛大鼠p-p38，BDNF， TNFα和IL-1β表达(n=4，P <0.01)。结论小胶质细胞上P2X4R激活后可能可以通过P38MAPK机制介导BDNF的释放并参与大鼠骨癌痛的发生。