牛circSGCB通过KLF3调控肌细胞增殖与分化的机制研究

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骨骼肌的生长和发育受许多因素调节。对于畜禽业,它反映了畜禽产肉的质量和产量。文献报道circRNAs作为新的关键候选因子可以调节肌肉细胞的发育。然而,尽管已在牛肌肉组织中检测出许多circRNA,但其中circRNA对肌肉细胞的调节功能和机制的研究目前尚处于初步的阶段。在这项研究中,通过分析实验室前期测得的秦川牛胚胎期和成年期骨骼肌中circRNAs的RNA-seq转录表达数据,筛选出了一个差异表达且与肌肉发育相关的circRNA(circSGCB)。通过circSGCB全长扩增、RNase R耐受性试验和表达检测来鉴定circSGCB的真实性。利用干扰circSGCB的功能丧失试验,通过q PCR、Western-blot、Ed U、CCK-8、流式细胞分析以及MYHC免疫荧光等方法探究circSGCB对牛肌肉细胞增殖和分化的影响。此外,通过生物信息学预测,表达检测和双重荧光素酶报告分析,检测circSGCB-miR-27a-3p-KLF3的靶向关系。进一步,通过过表达和干扰技术,研究bta-miR-27a-3p和靶分子KLF3对牛肌肉细胞增殖和分化的影响。最后,利用生物信息分析、初步测试(q PCR、Western-blot检测)及挽救试验,研究circSGCB-miR-27a-3p-KLF3参与PI3K/AKT通路的作用。这些研究可以说明,牛circSGCB通过ce RNA机制调节KLF3,并影响牛成肌细胞的发育。主要研究结果如下:1、circSGCB在牛肌细胞中通过吸附bta-miR-27a-3p调控细胞增殖和分化研究鉴定了circSGCB的真实性,circSGCB来自于其母源基因SGCB的第二外显子,长度为210 nt。利用干扰circSGCB的功能丧失试验,发现牛circSGCB抑制秦川牛肌原代细胞的增殖而促进其分化。进一步,核质定位检测表明circSGCB存在于牛肌细胞的细胞质。因此,通过RNAhybrid软件分析circSGCB的序列发现存在有miR-27a-3p的结合位点,依靠双荧光素酶报告检测和AGO2的RIP试验等验证两者存在结合作用。2、bta-miR-27a-3p可通过靶向抑制KLF3调控牛肌细胞增殖和分化利用过表达bta-miR-27a-3p的功能获得试验,表明bta-miR-27a-3p促进牛肌细胞的增殖而抑制其分化。进一步,通过Targetscan软件预测,发现bta-miR-27a-3p可以靶向KLF3基因的3’UTR,并通过双荧光素酶报告检测验证。此外,过表达牛miR-27a-3p后,发现KLF3表达水平被显著下调。3、KLF3抑制牛肌细胞增殖并促进其分化,且circSGCB-miR-27a-3p-KLF3参与PI3K/AKT通路在牛肌细胞中过表达和干扰KLF3基因后,检测发现KLF3抑制牛肌原代细胞增殖并促进其分化。通过小鼠CHIP-seq数据库和生信分析发现,KLF3可能结合PIK3R2基因的启动子区。过表达和干扰KLF3后,检测发现KLF3可抑制PIK3R2基因的转录,并抑制PI3K/AKT通路相关蛋白(IRS1/PDK1/PI3K/AKT)表达。在干扰circSGCB及过表达miR-27a-3p后,同样发现PI3K蛋白和AKT蛋白表达受到影响。进一步,通过在牛肌细胞中共转试验,发现过表达KLF3可以挽救干扰circSGCB导致的增殖相关基因的表达上调,并且减弱PI3K/AKT通路的信号传导。因此,circSGCB可通过结合miR-27a-3p,来解除miR-27a-3p对KLF3表达的抑制,从而影响PI3K/AKT通路来发挥调控牛肌细胞增殖与分化的作用。该研究是对相关牛肌肉发育复杂的分子网络的补充,为未来我国肉牛产业发展和分子育种提供理论基础。
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