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背景与目的:单病单靶点单成分治疗简单疾病已取得很大进展;复杂疾病,如抑郁症共病目前尚未有很好的解决方法;而中草药之多靶点或含中草药联合治疗具有巨大的潜在优势。但中草药的质量控制问题使中草药疗效可重复性、安全性及质量标准遭到质疑,其中关键的技术问题是中草药的代表性药效成分不清楚,2009年黄熙教授提出的BAP策略为解决这一基本问题提供了有效的思路和方法。在这一策略指导下,课题组已完成冠心II号、枳壳厚朴方、柴胡疏肝散等吸收体内成分的定性定量,并分别确定了这些成分中能代表母方90-108%疗效的效应成分,这些成分可看成是中草药质量控制的功效成分,也可用于监测中药方剂疗效的重复性和安全性等。但中草药质量控制还与煎煮、产地、品质等多因素相关。由此,本实验拟比较研究柴胡疏肝散(CSS)不同品质、来源、煎煮方法状态下的抗抑郁促动力舒血管作用的可重复性疗效范围,为中药方剂质量控制标准研究提供新证据、开辟新途径。方法:选用急性应激模型-强迫游泳(FST);强迫游泳15分钟,造模24 h后灌胃并进行强迫游泳5分钟不动时间测试和在体肠推进、胃排空以及冠脉流量实验。1.实验分10组:空白组(sham),模型组(vech),氟西汀组(flou),CSS-湘雅组(XY-CSS),CSS-老百姓组(LBX-CSS),CSS-同仁堂组(TRT-CSS),CSS-差品质组(差-CSS),CSS-省中颗粒剂组(SK-CSS),CSS-省中精货组(SJ-CSS),CSS-省中统货组(ST-CSS);每组8只SD雄性大鼠,体重220g左右,灌胃剂量均为30g/kg;检测:大鼠强迫游泳5 min不动时间、肠推进、胃排空以及冠脉血流积分指标并进行统计分析。2.采用UPLC-qTOF-MS法测定CSS-湘雅医院组(常用来源)汤剂中28个化学成分的含量,绘制各成分的标准曲线,并对其含量测定方法的专属性、线性范围、检测限、定量限、重复性、稳定性和加样回收率等指标进行考察。在此方法学基础上测定CSS-老百姓药店组(疗效优)、差品质组(疗效差)汤剂中28个化学成分的含量。3.不同加水量和煎煮时间的CSS抗抑郁行为学实验:煎煮CSS汤剂的加水量按组方重量的N倍进行煎煮,设成:12-12倍水、8-8倍水、4-4倍水;汤剂煎煮时间按武火煎煮沸腾后转文火煎煮的时间设置成60分钟、30分钟、15分钟;交叉分布排列总计18组,并将这些组别编号如下:a.12-12、b.8-8、c.4-4;d.30分钟、e.60分钟、f.15分钟。这部分实验又分为空白组、模型组、湘雅CSS-ad组、湘雅CSS-ae组、湘雅CSS-af组、湘雅CSS-bd组、湘雅CSS-be组、湘雅CSS-bf组、湘雅CSS-cd组、湘雅CSS-ce组、湘雅CSS-cf组;差药CSS-ad组、差药CSS-ae组、差药CSS-af组、差药CSS-bd组、差药CSS-be组、差药CSS-bf组、差药CSS-cd组、差药CSS-ce组、差药CSS-cf组。每组选用8只SD雄性大鼠,体重220g左右,检测大鼠强迫游泳5 min不动时间并进行统计分析。4.酶联免疫实验:在行为学实验测试结束后,将大鼠麻醉后取全血、海马、胃等样本并放置于-80℃冰箱保存。用酶联免疫测定法测定各组大鼠血浆中ACT、CRH、DA、NE、5-HT、IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、ROS、ghrelin,胃中ghrelin,海马BDNF及其受体TrkB等相关激素、蛋白含量,分析比较空白组、模型组、CSS-湘雅医院组和CSS差品质组间的差异结果:1.急性应激造模后,模型组大鼠的不动时间对比空白组大鼠明显增加,P<0.05,说明急性应激造模成功,且模型组对比空白组大鼠在体胃排空、肠推进明显减少。CSS组及阳性对照药氟西汀组相比模型组不动时间均明显减少,CSS-湘雅医院组(XY-CSS)在体胃排空、肠推进、冠脉血流积分(VTI)明显增加,有统计学意义;其他所有组别CSS-湘雅医院组(XY-CSS)、CSS-老百姓药店组(LBX-CSS)、CSS-同仁堂组(TRT-CSS)、CSS-江苏省中医院颗粒剂组(SK-CSS)、CSS-省中精货组(SJ-CSS)、CSS-省中统货组(ST-CSS)相比模型组不动时间明显减少且有统计学意义;差品质组(差-CSS)大鼠不动时间虽有减少但无统计学意义;CSS-省中精货组(SJ-CSS)胃排空率有增加,有统计学意义(P<0.05),其他几组有增加的趋势,但无统计学意义;CSS-老百姓药店组(LBX-CSS)灌胃后肠推进率增加,有统计学意义,其他几组肠推进率虽然有增加的趋势但并没有表现出明显作用,无统计学意义;CSS差品质组(差-CSS)灌胃后无增加肠推进作用且血流积分有增加趋势但并没有表现出明显作用,无统计学意义。2.汤剂中28种成分定量分析结果显示:CSS-湘雅医院组(XY-CSS)28种单体成分色谱峰分离较好,无明显杂峰干扰,在线性检测范围内线性回归良好,重复性好,相对标准差波动较小,加样回收率良好,汤剂样本24h内稳定;CSS-老百姓药店组(LBX-CSS)28种单体成分含量与湘雅医院组相比略有差别、CSS-差品质组(差-CSS)含量明显低于其他两组,且有部分物质未检测出。3.与模型组大鼠不动时间比较,在12-12倍水时,CSS-湘雅医院组(XY-CSS)15分钟和30分钟作用明显,有统计学意义,但在60分钟时不动时间虽有减少但无统计学意义;8-8倍水时,不动时间均有减少但只有15分钟有统计学意义,30分钟和60分钟无统计学意义;4-4倍水时,所有时间点均无统计学意义。CSS差品质组(差-CSS)则在8-8倍水15分钟煎煮条件下有统计学意义,其他煎煮时间和倍水均无统计学意义。4.急性应激造模后,模型组与空白组相比大鼠血浆中的HPA轴激素亢进,单胺类神经递质水平明显降低,炎性因子、氧化性因子的水平有升高,BDNF水平下降,ghrelin含量降低;CSS-湘雅医院组改善了血浆中IL-1β3、IL-6、TNF-α、MDA、NE、DA、海马及胃组织ghrelin等水平,所有结果均有统计学意义。CSS差品质组中各项生化指标只有海马KYN和IDO水平、海马受体TrkB、血浆和胃中的 Ghrelin、血浆 IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、NE、DA 有一定的改善,且有统计学意义。结论:CSS具有抗抑郁促胃肠动力舒血管作用,在同一煎煮条件下(12-12倍水,30分钟)CSS-江苏省中医院统货组(ST-CSS)抗抑郁效果最好,其次是CSS-江苏省中医院颗粒剂组(SK-CSS);CSS-湘雅医院组(XY-CSS)促动力效果最好;在不同加水量和煎煮时间变量下,湘雅医院组(XY-CSS)以及差品质组(差-CSS)CSS汤剂疗效分别在8-8倍水、15分钟条件下较好;本实验成功建立了同时测定柴胡疏肝散中阿魏酸、水合橙皮内酯等28个化学成分的含量的UPLC-qTOF-MS分析方法,该方法操作简便、快速、灵敏度高且根据测定结果显示不同品级的CSS中同一成分含量之间的差异;本实验采取酶联免疫测定法,成功地从血浆,胃,脑内蛋白及其受体等角度观察了不同品级的CSS的抗抑郁促动力舒血管疗效及其差异;本实验获得的CSS可重复显效抗抑郁(不动时间:144.6±58.56~64.3±30.42)促动力(肠推进:57.99±10.14%~75.28±8.10%;胃排空:41.9±8.4%~74.14±15.06%)舒血管(冠脉血流积分:24.49 ±1.92~25.46±4.84)的饮片范围与代表成分的含量范围(水合橙皮内脂:79.5~249.87ng/g;阿魏酸:136.37~154.91ng/g)。