纳他霉素属于多烯大环内酯类抗生素,是一种高效、广谱、安全的抗真菌剂。纳他霉素是链霉菌发酵产生的次级代谢产物,但目前较低的发酵水平造成了其生产成本较高,限制了其进一步的使用。本研究以一株具有自主知识产权的纳他霉素工业高产菌株恰塔努加链霉菌L10(Streptomyces chattanoogensis var. L10)为研究材料,对其纳他霉素生物合成基因簇、参与途径特异性调控和多效调控的多个调控因子进行了深入的研究,探索其高产的分子机制,并为利用基因工程技术构建纳他霉素工业高产菌奠定基础。本研究首先通过文库构建、文库筛选和染色体步移等方法克隆了L10中的纳他霉素生物合成基因簇scn,并通过对两个途径特异性正调控基因scnRⅠ和scnRⅡ的敲除进行了验证。采用5’RACE和RT-PCR技术全面分析了scn基因簇的转录结构。体外凝胶阻滞电泳实验和体内转录分析表明ScnRII能够直接激活scn基因簇内全部基因的表达,而ScnRⅠ则是间接影响基因簇内所有基因的转录。通过生物信息学方法对scn基因簇与纳他尔链霉菌中的同源基因簇pim进行了比较基因簇分析,结果表明两个基因簇不仅具有不同的基因构成,而且具有不同的转录结构,并发现scn基因簇可能是恰塔努加链霉菌通过基因水平转移而得到。两个基因簇转录水平的比较也为抗生素生物合成基因簇的进化研究提供了新的思路。本研究还通过同源克隆的方法得到了参与L10中形态分化与次级代谢等过程调控的adpA-Ch和丁内酯CHB调控系统相关基因scgA、scgX和scgR。基因敲除和转录水平分析表明adpA-Ch是形态分化与次级代谢过程(黄色素和纳他霉素生物合成等)的正调控基因,在其敲除菌株ZJUD5(AadpA)中纳他霉素生物合成的途径特异性正调控基因scnRⅠ的转录水平显著下降,仅为出发菌株L10的5%左右,而scnRⅡ的mRNA丰度并没有显著变化。表明adpA-Ch对纳他霉素的生物合成的调控至少是部分通过对scnRⅠ的调控来实行的。但凝胶阻滞电泳实验表明AdpA-Ch并不能直接结合在scnRⅠ的启动子上,因此其对scnRⅠ的调控是间接调控,可能是通过某个中间调控基因介导的。L10中的丁内酯信号分子CHB调控系统包括scgA、scgX和scgR,其中ScgR编码CHB受体蛋白,scgA和scgX编码参与CHB生物合成的合成酶。基因敲除实验表明CHB系统是L10形态分化与纳他霉素合成等次级代谢过程正确起始所必须的,CHB缺失的突变株表现出生长缺陷和形态分化与次级代谢等过程滞后等现象,同时碳源依赖性表型表明CHB也参与了碳源利用等过程。凝胶阻滞电泳实验和体内转录分析揭示了CHB受体蛋白ScgR能够结合在合成酶ScgA的启动子上抑制其转录,而ScgR的DNA结合活性能够受到CHB的抑制,这些结果表明CHB生物合成受到其自身正反馈调控,同时在scgA与scgX的基因缺失株中scgA的mRNA丰度显著上升,暗示着CHB生物合成还受到其自身介导的负反馈调控系统的调节。采用Genomic SELEX技术筛选到CHB系统下游的另一个靶基因gbdA,但其突变株表型分析显示gbdA并不介导CHB下游的信号转导。同时对scnRⅠ和scnRⅡ及其整个纳他霉素生物合成基因簇的转录分析表明CHB系统对纳他霉素生物合成的调控可能是位于前体水平的调控。比较蛋白质组学揭示了CHB系统的调控元包括至少50个以上的基因,受其正调控的蛋白主要为参与糖酵解、TCA循环、磷酸戊糖途径、核酸和氨基酸合成、胁迫应答、能量代谢和蛋白质合成等过程的蛋白。而受CHB负调控的蛋白主要为参与碳源摄取与代谢等过程的酶类。研究结果首次揭示了链霉菌中丁内酯调控系统参与碳源摄取及初级代谢过程。