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二十碳五烯酸(EPA)是一种ω-3多不饱和脂肪酸,具有抗炎、抗癌、抗凝血、降血脂、防心血管疾病等多种生理功能。然而,EPA主要来源于深海鱼油,由于鱼类资源的有限、海洋环境的污染与提取工艺的复杂性,寻找可持续发展的EPA替代来源成为研究热点。其中,微生物油脂受到广泛关注并研究。产油微生物高山被孢霉油脂含量高、多不饱和脂肪酸(PUFAs)种类丰富,是经过FDA安全认证的用于生产花生四烯酸的工业化菌株。课题组前期通过过表达ω-3脂肪酸脱饱和酶PPD17获得重组菌株高山被孢霉CCFM698,实现了常温下将ARA转化为EPA的突破。为了进一步提高菌株的生产能力,本文进行了一系列的发酵工艺优化,并提出了一种基于溶氧与两阶段pH调控高山被孢霉高产EPA的补料发酵工艺。最后,将高山被孢霉作为PUFAs饲料添加剂应用于蛋鸡饲料中,考察其对鸡蛋与蛋鸡组织PUFAs组分的影响。主要研究结果如下:1.在摇瓶发酵基础上,确定了分批发酵的最适碳氮源添加比例为50 g/L葡萄糖与20 g/L豆粕。在7.5 L发酵罐实验中,分别针对发酵罐转速、富氧介质以及富氧空气等影响发酵体系溶氧的因素进行了考察。研究结果表明,发酵罐转速为400 r/min时可以防止剪应力过大对高山被孢霉菌体造成损伤,然而该转速条件无法满足菌体生长与脂质积累过程中的高溶氧需求。因此进一步对溶氧供给进行了研究,结果表明添加富氧介质4%正己烷可以提高发酵体系的溶氧,但正己烷不利于菌体生长与EPA的积累;而采用富氧空气策略维持发酵体系相对溶氧在30%左右可以有效满足溶氧需求,且EPA产量相比优化前提高了1.8倍。因此选择富氧空气策略作为发酵过程中的溶氧调控措施。2.由于富氧空气策略下糖耗速率剧增,分批发酵后期葡萄糖供应不足阻碍了脂质的合成与积累,因此进行了补料工艺研究。补料工艺研究结果表明,残糖反馈补料控制初始葡萄糖含量为30 g/L,通过间歇性补料维持残糖浓度在10~30 g/L,使得EPA的产量提高了79.1%。不同pH控制策略研究结果表明,氨水流加法能有效提高高山被孢霉的生物量和产脂水平,且高山被孢霉菌体生长的最适pH为6.0,脂质积累的最适pH为6.5。综上研究提出一种基于溶氧与两阶段pH调控高山被孢霉高产EPA的补料发酵工艺,最终菌体生物量可达41.2 g/L,总脂占菌干重31.6%,EPA产量高达3.5 g/L,该EPA产量为目前在高山被孢霉中的最高产量。3.通过蛋鸡实验研究高山被孢霉作为PUFAs饲料添加剂对鸡蛋与蛋鸡组织PUFAs组分的影响。研究结果表明随着高山被孢霉添加比例的增加,鸡蛋中的ARA、DPA与DHA含量逐步增加,ω-6/ω-3 PUFAs的比值逐渐下降,其中添加2%高山被孢霉在补充期末期时鸡蛋中的ARA、DPA与DHA含量分别提高21.1%、67.9%与68.9%,ω-6/ω-3PUFAs比值下降28.6%。另外,添加高山被孢霉可以显著降低蛋鸡组织的ω-6/ω-3 PUFAs的比值。其中添加2%高山被孢霉在补充期末期时鸡肝、鸡血、鸡胸肉中ω-6/ω-3 PUFAs比值分别下降46.5%、61.4%与73.7%。