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目的:(1)构建p53基因下游的损伤调节自噬调控基因(damage-regulated autophagy modulator,DRAM)过表达腺病毒载体(Admax-pDC315-DRAM-EGFP)。(2)Admax- pDC315-DRAM-EGFP转染人中分化胃癌SGC7901细胞,观察DRAM基因对胃癌SGC7901细胞增殖、自噬及凋亡的影响。方法:(1)从cDNA文库中,利用PCR方法获取目的基因DRAM序列。将目的基因与真核表达载体pDC315-EGFP分别用EcoR I进行酶切,酶切产物电泳回收后进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞。细胞克隆先行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性克隆进行测序和比对分析,比对正确即为构建成功的目的质粒pDC315-DRAM-EGFP,将其再与辅助包装质粒pBHGF35共转染293细胞,同源重组,包装扩增得到重组腺病毒Admax-pDC315-DRAM-EGFP。利用293细胞扩增病毒并进行纯化,测定纯化后病毒滴度,选择最佳感染复数并测定其对胃癌SGC7901细胞的转染效率。(2)Admax-pDC315-DRAM-EGFP转染人胃癌SGC7901细胞,镜下观察细胞形态变化,采用MTT法测定SGC7901细胞增殖的受抑情况;应用LC3免疫荧光标记法观察胃癌SGC7901细胞中自噬特异性蛋白LC3的分布和表达变化;采用Western-blot检测胃癌SGC7901细胞中p53、Bcl-2、beclin-1蛋白表达情况。结果:(1)酶切、连接产物基因测序结果与目的序列完全吻合,表明DRAM基因正确插入真核表达载体pDC315-EGFP。构建的能转染SGC7901细胞的重组腺病毒Admax-pDC315-DRAM-EGFP纯化后滴度达2.8×109 IU/ml。当感染复数(MOI)达60时转染效率最大,此时腺病毒对SGC7901细胞的转染效率(绿色荧光细胞数/总细胞数)为93±5.4%。(2)重组腺病毒转染SGC7901细胞后:随着时间的延长,对癌细胞增殖的抑制作用逐渐增强(40μl Admax-pDC315-DRAM-EGFP在作用24h、48 h、72 h时,对细胞增殖的抑制率分别为12.69±2.43%, 38.49±1.31%和69.15±2.50%,与阴性对照组相比,都有显著性差异(P<0.05));随时间的延长,细胞内自噬特异性蛋白LC3的表达逐渐增强,且分布呈弥散趋势;用SigmaScan Pro 5软件对Western Blot结果图像进行采集计算,空白组、阴性对照组、重组腺病毒转染24h组和重组腺病毒转染48h组p53蛋白表达水平分别为:1912416、2614012、3272305、4982792,相对比值为:1/1.37/1.71/2.61; beclin-1表达水平分别为678110、593149、1149591、987640,相对比值为:1/0.87/1.70/1.46;bcl-2蛋白表达水平分别为362689、346132、227493、160150,相对比值为:1/0.95/0.63/0.44。结论:本实验设计并合成的目的基因DRAM的载体重组腺病毒Admax-pDC315-DRAM-EGFP,能成功转染人胃癌SGC7901细胞,转染后SGC7901细胞增殖明显受到抑制,自噬特异性蛋白LC3的表达逐渐增强,抑癌基因p53的表达产物p53蛋白和启动自噬的关键蛋白质beclin-1表达随时间延长逐渐增强,而抑制细胞凋亡的bcl-2蛋白表达则明显减弱。由此我们推断DRAM可诱导自噬并上调p53介导的凋亡水平。