常规DNA克隆是将各种来源的遗传物质与载体DNA相结合,通过转化宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子,最终形成具有自我复制能力的DNA分子的过程。该技术的出现和发展是推动代谢工程和合成生物学繁荣的基石之一。大肠杆菌因其生长迅速、制备感受态方便、简单等原因一直是DNA克隆技术的核心宿主之一。DNA克隆共包含DNA片段的结合和DNA向宿主细胞内转化两个过程。本论文试图通过探索更优的DNA组装和DNA转化方法,搭建出更高效的新克隆体系,以实现更高效简便的多片段及大片段DNA克隆。DNA片段连接最早在体外进行,依赖T4 DNA连接酶的连接反应已经写入教科书。近10年出现了多种更简便高效的基于同源重组DNA组装技术,可被分为体内和体外两种。体外DNA组装主要是DNA片段通过使用体外酶系处理以实现目的DNA片段的连接,这种方法现在应用普遍。体内组装方法主要是借助微生物的短同源臂重组能力（intracellular homology-dependent DNA assembly,InHDA）,使得DNA片段直接在宿主细胞中进行重组连接。该方法无需体外酶系处理,操作也更简便。目前常用的体内DNA组装宿主主要包括酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。酿酒酵母因其超强的重组能力是常用的体内DNA重组的宿主,但酵母的DNA转化过程繁琐,生长周期较长、克隆富含重复序列片段易发生片段丢失。大肠杆菌因其生长周期短,分子操作简单也是体内DNA组装的良好宿主,它也具有短同源臂重组能力,但效率较低,其体内的重组机制一直未被阐明,这是限制其在克隆技术上广泛应用的主要原因。对大肠杆菌InHDA过程的阐述有利于更好的开发高效DNA克隆方法。DNA转入大肠杆菌的方法包含化学转化和电穿孔。转化的高效率决定了DNA的克隆效率,有利于多个片段同步克隆和DNA文库构建等操作。虽然电转化效率可达到1010 CFU/μg DNA,但它对设备和转化DNA的质量要求较高,这限制了它的大规模使用。常规DNA克隆通常选择化学法进行,尽管已经有多种化学感受态制备方法被建立,但在常规实验室条件下其效价最高只能达到108 CFU/μg DNA,与商业化感受态细胞的效价相差一个数量级。在常规实验室水平下开发出高效价的感受态细胞制备方法将有利于克隆工作的进行。为了解决上述问题,本文主要做了三方面工作:1.揭示了大肠杆菌胞内InHDA途径以RecA-的大肠杆菌XL1-Blue MRF’为背景菌株,首先建立了一种定量衡量InHDA活性的方法,为进一步探索InHDA重组机制奠定了基础。根据已报道的三条已知重组途径,依次构建了重组途径所涉及的基因敲除株,经验证发现它们并没有参与InHDA过程。这表明InHDA过程与已报道同源重组途径不存在交叉,应该是一条全新途径。据此,我们提出新假设:InHDA的过程应需要核酸外切酶的参与创造出单链末端,并构建出缺失3’-5’单链、3’-5’双链、5’-3’单链、5’-3’双链的核酸外切活性或者缺失了活性的进一步组合的多基因敲除株。对这些敲除株进行InHDA活性检测,发现同时缺失3’-5’双链DNA核酸外切酶ExoX和ExoⅢ的菌株会导致InHDA活性下降一个数量级,这预示着它们共同参与了这个过程。后通过回补和体外实验明确这一结论。进一步探究了在InHDA途径中可能参与的DNA聚合酶与DNA连接酶。采用类似策略构建了五种DNA聚合酶的单敲除株,证明了 DNA聚合酶Ⅰ（Pol Ⅰ）的参与,通过将Pol Ⅰ不同活性位点点突变回补实验,进一步明确了 Pol Ⅰ的5’-3’DNA聚合酶活性、5’-3’核酸外切酶活性和链置换活性都在InHDA途径中发挥了作用。接着对编码DNA连接酶的ligB进行敲除,表明ligB基因的敲除不影响InHDA的效率。ligA基因是必需基因,我们采用了编码热不稳定功能的LigA基因进行了替换,构建出了含有热不稳定的LigA缺失株。最终证实了 LigA参与了 InHDA修复。根据上述实验结果,最终探明了大肠杆菌InHDA的基本途径。2.构建了一株具有高转化效价的大肠杆菌BW3KD第一部分工作中我们发现BW25113菌株较其他几株克隆型大肠杆菌的转化效价高。基于此发现,我们展开了系统研究,希望可以构建出一株具有更高效价的大肠杆菌克隆菌株。首先使用三种不同的感受态制备方法,分别将BW25113与常用的克隆菌株进行了感受态效价比较,明确了在使用TSS感受态制备方法的条件下,BW25113具有优于其他克隆菌株100倍以上的高效价。接着对BW25113与其他克隆型菌株基因型进行比较,通过基因敲除和基因回补,确定了 RecA对维持感受态效价的重要作用。选择感受态制备及转化过程的细胞进行克隆计数,进一步明确了 RecA通过提高固体培养基上活细胞的存活数量进而影响效价。进一步敲除了 BW25113的endA、fuhA、deoR基因,获得了未影响效价且更适合克隆的菌株BW3KD。根据上述结果,最终获得了一株具有高效价的RecA+的克隆型菌株BW3KD。RecA被认为会造成质粒不稳定,我们系统分析了 RecA对质粒稳定性的影响。使用BW25113菌株尝试构建带有定向重复序列、串联重复序列、与基因组有重复序列的质粒及使用不同复制子类型的质粒,并对BW25113菌株的DNA组装效率和质粒稳定性分别进行测试。结果表明所有克隆过程均可顺利进行,并且RecA+也并未影响质粒的稳定性。只有pUC19复制子的质粒出现了微弱的二聚体形式,但我们的结果表明质粒的二聚体形式对质粒的稳定性没有影响。上述结果预示着RecA的存在不会影响常规克隆工作。3.系统优化TSS感受态制备方法进一步提高了 BW3KD的感受态细胞效价以BW3KD的高效价制备方法为基础,同时受到Hanahan与Inoue等高效价感受态制备方法的启发,从缓冲液配制和转化热激步骤两方面对现有感受态制备方法进行优化,得到的一种新的感受态制备方法TSS-HI。使用不同的克隆型大肠杆菌菌株进行效价测试,与TSS法相比,TSS-HI普遍提高了感受态细胞的效价,最多提高了 19倍。这表明TSS-HI是一种具有普适性的方法。我们发现来源于BW25113的菌株BW3KD具有生长快速、优于其他克隆菌株的高效价等特征。用TSS-HI法制备的BW3KD菌株的感受态细胞效价可稳定达到7.21×109±1.85×109 CFU/μg DNA,达到Thermo商业化DH5α-Tl感受态效价的3.2倍,TransGen商业化trans5α感受态细胞效价的436倍,可达到实验室水平下的电转化感受态细胞的水平。用TSS-HI法制备的BW3KD感受态细胞开展了对多片段和大质粒组装的应用,该方法制备的感受态可成功进行7片段的DNA克隆、组装20 kb的大片段或者转化80 kb的大质粒。这表明大肠杆菌TSS-HI法制备的BW3KD感受态细胞可以应用于多种DNA克隆工作。综上,本论文从体内DNA组装角度证明了大肠杆菌胞内短同源臂重组新机制,并从DNA转化角度的菌株构建和感受态方法制备两个方面进行探究,开发了一株高效价菌株BW3KD和一种高效感受态制备方法TSS-HI,为高效简便的进行多片段及大片段DNA克隆提供了理论和技术支持。