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实验目的:目前关于肺癌发生机制的研究主要集中于分子和细胞生物学水平,包括抑癌基因在内的相关基因的失活在非小细胞肺癌(NSCLC)的发生发展过程中发挥重要作用。基因的失活方式有很多,而启动子 CpG 岛的异常甲基化受到越来越多的重视。最近的研究证实启动子 CpG 岛甲基化可能在 NSCLC 发生发展过程中都发挥重要作用,并且是导致抑癌基因失活的重要机制。本实验通过检测28 个肿瘤相关基因启动子 CpG 岛甲基化在 43 例非小细胞肺癌癌组织和癌旁组织以及 10 例良性肺部疾病肺组织中的发生率,探讨上述基因的甲基化与性别、年龄、吸烟、细胞病理类型、细胞分化程度及 TNM 临床分期的关系,建立 NSCLC 较为完整的相关基因甲基化谱,为临床早期诊断 NSCLC 提供理论依据。我们还在 4例肺癌细胞株检测了发生甲基化的细胞株 mRNA 的转录水平,并与去甲基化的基因对照,进一步阐明基因启动子 CpG 岛的甲基化与 mRNA 转录水平之间的关系。 实验方法:应用酚/氯仿法按常规抽提组织的基因组 DNA,经过亚硫酸盐处理,应用甲基化特异的 PCR (methyl-specific PCR,MSP)方法检测 43 例 NSCLC 癌组织、癌旁组织及肺部良性疾病的肺组织 28 个基因的甲基化发生率。将 PCR 产物回收,应用腺病毒载体构建重组体导入大肠杆菌中,培养后挑选克隆测序,同时测定甲基转移酶(Sss I methylase)处理良性肺部疾病基因组 DNA 后再次测定甲基化状态。4 例肺癌细胞株 SPC-A1、SH-77、NCl 和 A549 按常规方法复苏,传代细胞株, 应用酚/氯抽提细胞 DNA 和 TriPure 抽提 RNA,测定 12 个基因发生的甲基化的状态,选择有意义的基因应用 RT-PCR 检测 mRNA 转录水平。 实验结果:我们共检测了 APC、AR、DAPK、ABO、GSTPI、MAGEA1、MGMT、MYOD1、p16INK4a、p21WAF、p14ARF、p15INK4b、p73、RAR-β、RASSF1a、WT1、Rb、TIMP-3、VHL、OCT6、N33、E-cad、CDH13、DNMT1、PTEN、hMLH1、mint31 和 cox-2 等 28个基因的甲基化发生情况,我们发现 ABO、p14ARF、p15INK4b、Rb、GSTPI、TIMP-3、VHL、DNMT1、PTEN、hMLH1、mint31、cox-2 等 12 个基因在 NSCLC 和良性肺部疾病的肺组织均未发生甲基化,而N33和MAGEA1在NSCLC和良性肺病组织中都发生了甲基化,包括 E-cad、DAPK、APC、MYOD1、p16INK4a、WT1、CDH13、MGMT、RASSF1a、RAR-β、p73、AR、p21WAF 和 OCT6 等 14 个基因在肺癌或者癌旁组织中发生了甲基化而在良性肺部疾病肺组织中无甲基化发生。这些基因在癌组织和癌旁组织的甲基化率分别是 E-cad 为 23%与 19%,DAPK 为 35%和 26%,APC 为 21%和 23%,MYOD1为 40%和 19%,p16INK4a 为 42%和 44%,WT1 为 51%和 28%,CDH13 为 37%和19%,MGMT26%和 26%,RASSF1a 为 35%和 21%,RAR-β为 28%和 19%, p73 为 44%和16%,AR 为 23%和 16%,p21WAF 为 28%和 16%,OCT6 为 23%和 9%,除 APC、p16INK4a和 MGMT 外其余 11 个基因都是癌组织的甲基化率高于癌旁组织,并且在 MYOD1、 1<WP=7>28 个肿瘤相关基因启动子 CpG 岛甲基化及转录与非小细胞肺癌相关性的研究WT1、p73 基因两者甲基化率的差异均达到统计学意义(p<0.05 或 p<0.01) 。男性和女性的甲基化率分别是 E-cad 为 22%与 27%,DAPK 为 34%和 36%,APC 为 22%和18%,MYOD1 为 41%和 36%,p16INK4a 为 34 %和 64%,WT1 为 50%和 55%,CDH13 为 41%和 27%,MGMT 为 28%和 18%,RASSF1a 为 34%和 36 %,RAR-β为 25 %和 36%, p73 为44%和 45%,AR 为 19%和 36%, p21WAF 为 28%和 27%,OCT6 为 22%和 27%。14 个基因基因男女甲基化率均无统计学差异。43 例 NSCLC 按年龄≤65 岁和>65 岁分为两组,甲基化率分别是 E-cad 为 24 %与 22%,DAPK 为 32%和 44%,APC 为 21%和22%,MYOD1 为 41%和 33%,p16INK4a 为 47 %和 22%,WT1 为 50%和 56%,CDH13 为 35%和 44%,MGMT29%和 11%,RASSF1a 为 26%和 67 %,RAR-β为 26%和 33%, p73 为 41%和 56%,AR 为 26%和 11%, p21WAF 为 32%和 11%,OCT6 为 26%和 11%,其中>65 岁组RASSF1a 甲基化率明显高于≤65 岁组(p<0.05)。 43 例 NSCLC 按吸烟史分为无吸烟史和有吸烟史两组,14 个基因癌组织的甲基化率分别是 E-cad 为 26%与21%,DAPK 为 26%和 42%,APC 为 21%和 21%,MYOD1 为 42%和 38%, p16INK4a 为 42%和 42%,WT1 为 42%和 58%,CDH13 为 37%和 38%,MGMT 为 5%和 42%,RASSF1a 为 37%和 33 %,RAR-β为 26 %和 29%, p73 为 37%和 50%,AR 为 16%和 29%, p21WAF 为 26%和 29%,OCT6 为 16%和 29%,其中 MGMT 吸烟史组甲基化率高于无吸烟史组,差异有统计学意义(p<0.05)。43 例 NSCLC 按病理类型分为腺癌和鳞癌组甲基化率分别是 E-cad 为 19 %与 27%,DAPK 为 33 %和 36%,APC 为 33 %和 9%,MYOD1 为 46%和32%,p16INK4a 为 29 %和 55%,WT1 为 48%和 55%,CDH13 为 52%和 23%,MGMT 为 24%和 27%,RASSF1a 为 43%和 27 %,RAR-β为 24 %和 32%, p73 为 43%和 45%,AR 为 33%和14%, p21WAF为19%和36%,OCT6为24%和23%,其中APC、MYOD1、CDH13、RASSF1a、AR和OCT6腺癌组