丙型肝炎病毒（HCV）感染是引起慢性肝脏疾病的主要病因之一，全球估计有1.8亿人感染HCV，而在我国感染人数已超过4000万。50％-85%的HCV感染患者早期无症状，由于HCV病毒生物学特性、宿主免疫功能等多种因素造成机体免疫系统难以有效的清除病毒，易发展为慢性感染。随着感染的持续存在可能会出现肝功能衰竭等一系列表现，甚至是肝硬化和肝癌。因此HCV感染是我们面临的严峻的公共卫生问题之一。目前HCV的标准治疗方案是聚乙二醇干扰素α（PEG-IFN-α）和利巴韦林联合治疗，其有效率为40%-60%，费用昂贵，副作用较大，且针对HCV不同型别的持续病毒应答率（SVR）也有差别。近年来国外研制经FDA批准上市的NS3/NS4A蛋白酶抑制剂Simeprevir和NS5B聚合酶抑制剂Sofosbuvir虽然SVR达到95%-100%，但是价格极其昂贵，仅针对1型效果较好，限制了其推广。因此HCV疫苗是预防丙肝和缓解其带来的沉重社会负担的最经济，最有效的医学手段。由于HCV基因组高度变异，尤其是其包膜蛋白存在高变区，同时缺乏合适的HCV体外病毒培养系统和小动物模型，以及中和抗体评价方法的不足，导致HCV预防疫苗的研制困难重重，至今未能取得突破。　　感染HCV后，病毒的核心蛋白、包膜蛋白以及非结构蛋白都可以诱导机体产生抗体。然而这些蛋白诱导产生的抗体中，只有针对包膜蛋白E1、E2的中和抗体，才有保护作用。近年来研究发现，针对包膜蛋白的单抗具有广谱交叉中和活性，与HCV急性感染转归有关。因此，寻找包膜蛋白上保守的中和表位，通过其广谱交叉中和活性产生的抗体发挥作用，是研究预防性疫苗的新思路。同时，随着HCV假病毒颗粒（HCVpp）和HCV体外复制培养系统（HCVcc）研究中和抗体方法的建立和成熟，为预防疫苗的研制带来了希望。　　本研究结合HCV中和表位最新的研究进展，将具有广谱交叉活性的中和抗原表位串联，把串联表位嵌合在HBVS抗原的氨基端胞外区，利用HBVS抗原具有自我装配成VLPs以及携带外源性抗原的能力，制备了嵌合HCV串联多中和表位的HCV-HBV病毒样颗粒（VLPs）；同时用同样方法制备了嵌合HCV包膜蛋白E2的VLPs。对两种病毒样颗粒进行鉴定、纯化、浓缩后免疫新西兰兔，检测两种 VLPs诱导产生抗体的情况和水平上的差异，同时制备了用于评价中和抗体作用的1b、2a型HCVpp，观察兔免疫血清对HCVpp感染Huh-7.5细胞的抑制作用，为进一步研究HCV预防疫苗研究提供实验依据。　　目的　　构建HCV串联多中和表位与HBVS抗原嵌合基因真核表达质粒，在293T细胞中进行表达；制备嵌合HCV串联多中和表位和HCV包膜蛋白E2的两种HCV-HBV病毒样颗粒（VLPs），鉴定后免疫新西兰兔，并对获得的兔免疫血清中抗体的水平进行分析，进而观察其对HCVpp感染Huh-7.5细胞的抑制作用。　　方法　　1．将HCV中高度保守同时有广谱交叉活性的三个中和表位与一个HVR1模拟表位串联。把串联表位嵌合于HBV S基因的氨基端胞外区，形成嵌合基因MEpS，克隆到真核载体pCI-neo中，构建重组质粒pCI-MEpS；扩增HCV E2基因，用同样的方法构建重组质粒pCI-E2S。重组质粒转染293T细胞，间接免疫荧光及Western blot检测嵌合基因的表达情况。　　2.重组质粒pCI-MEpS和pCI-E2S转染293T细胞，3天后收集培养细胞的上清，Amicon Ultracell-15100K离心过滤器浓缩离心，获得浓缩的VLPs。通过蔗糖密度梯度离心（25%-60%）纯化VLPs，通过对离心后每一层蔗糖溶液的HBsAg定量测定，收集高浓度片段，得到富集VLPs。透析除去蔗糖，再浓缩后得到纯化的病毒样颗粒。Western blot和电镜分析鉴定VLPs。　　3.将18只新西兰兔分为六组，每组3只。分别命名为VLPs-MEpS，VLPs-E2S，VLPs-HBS，Vaccine，Adjuvant（MF59），PBS。纯化的10?g的VLPs与佐剂MF59混合成油包水状后，皮下注射免疫新西兰兔；商品化的乙肝疫苗，佐剂和PBS作为对照。一共免疫三次，每次间隔两周。不同时间点留取兔血清，间隔两周，分装后-20℃保存。以合成多肽为包被抗原，ELISA法检测收集的血清内抗体的水平和差异。　　4.构建1b、2a型的HCVpp，确定转导单位。将三种不同 HCV假病毒包装质粒：HCV包膜质粒pVRC-E1E2（1b、2a型），包装质粒pHR′CMVΔ8.2及转移质粒pCS-CG按照3μg:6μg:9μg（每75cm2培养瓶）转染293T细胞，分别在48h和72h时通过荧光显微镜观察转染后 EGFP表达情况，并各收获一次细胞上清。收获的上清7000rpm，4℃离心10min；0.45μm滤器过滤；离心过滤器（Amicon Ultracell-100K）浓缩离心，得到浓缩的HCV假病毒颗粒（HCVpp）。Western blot鉴定得到的假病毒颗粒中HCV E1、E2的表达。HCVpp不同稀释度转染2.0×105Huh7.5细胞，根据不同稀释度下流式细胞仪计数的EGFP阳性细胞比率计算HCVp p的感染转导单位（TU）。以EGFP阳性率达到50%为最佳稀释浓度。TU计算方法：TU/ml=（初始靶细胞数/HCVpp ml体积）×（EGFP阳性细胞的百分率/100）。将不同稀释度的兔免疫血清与合适转导单位的HCVpp混合，室温孵育1h，加入1.0×105Huh7.5细胞。48~72h后流式细胞仪计数表达 EGF P的阳性细胞比率，PBS免疫血清为非抑制对照。计算中和抗体中和率（抑制率%），计算方法：中和率=（%EGFP对照组-%EGFP实验组）/%EGFP对照组。　　结果　　1.琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增出预期的截短的HBS、MEp和HCV E2片段，大小分别为666bp，255bp，1092bp，T-easy连接后测序正确。酶切后pCI-neo、截短的HBS、MEp（或HCV E2）三片段过夜连接，酶切鉴定pCI-MEpS、pCI-E2S分别得到大小为921bp、1758bp的片段。间接免疫荧光显示pCI-MEp S和pCI-E2S转染的293T细胞胞浆内相比于对照组可见较强的绿色荧光。Western blot显示pCI-MEpS在相对分子量约35kDa，38k Da（糖基化后）处可见蛋白条带，pCI-E2S在相对分子量65kDa，97kDa（糖基化后）处可见蛋白条带。　　2.重组质粒pCI-MEpS、pCI-E2S转染293T制备VLPs，浓缩收集的上清经Western blot鉴定，VLPs- MEpS在约38kDa处、VLPs-E2S在约97kDa处可见蛋白条带。纯化浓缩VLPs负染电镜下观察可见大小22nm左右的球形颗粒。HBsAg定量测定浓度可达30×103ng/ml。　　3.ELISA法检测兔免疫血清中抗体的水平。OD值结果显示VLPs-MEpS组和VLPs-E2S组相比对照组明显检测到血清中的抗体，VLPs-MEpS组高于 VLPs-E2S组。　　4.1b、2a型的HCVpp的包装，48 h、72 h荧光显微镜下均可见到明显的荧光。收集培养上清，过滤浓缩，Western b lot显示在相对分子量约35 k Da、58kDa处可见蛋白条带。一定转导单位的1b型HCVpp与兔免疫血清混合后感染Huh7.5细胞，结果发现免疫血清中抗体对HCVpp感染Huh7.5具有一定的抑制作用，抑制作用在42天达到高峰，VLPs-MEpS组高于VLPs-E2S组。　　结论　　成功构建了嵌合HCV串联多中和表位和HCV包膜蛋白E2的乙肝S抗原真核载体表达质粒，并在293 T细胞中表达。成功制备了嵌合HCV串联多中和表位和HCV包膜蛋白E2的两种HCV-HBV病毒样颗粒（VLPs）。嵌合病毒样颗粒在兔体内诱导产生了抗体，反映了串联多中和表位较好的免疫性。成功包装出1b、2a型的HCVpp，同时兔免疫血清中抗体对1b型HCVpp感染Huh7.5细胞起到了一定的抑制作用，表明串联多中和表位嵌合病毒样颗粒诱导产生了具有保护作用的中和抗体。