心血管疾病（cardiovascular disease,CVDs）作为主要的非传染性疾病之一,其发病率和致死率一直都在全世界范围内位居首位。统计显示,2015年因心血管疾病死亡人数达到了1770万,并且呈现出不断上升的趋势。据世界卫生组织预测,因心血管疾病死亡的人数将在2030年达到2360万。动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）被认为是许多心血管事件发生的共同病理基础,与心、脑等全身多个脏器的临床事件有关,但迄今为止降脂仍为其主要手段,且疗效仍较有限;临床现实呼唤对其新发病机制的探索。尽管许多证据表明炎症和免疫效应参与了动脉粥样硬化发生的过程,近年AS也被称之为慢性炎症性疾病;然而,孕期炎症刺激与子代动脉粥样硬化发生的关系尚未见报道。本实验室前期研究中发现,孕期炎症刺激导致子代大鼠发生高血压,并出现体重增加、血脂异常、向心性肥胖等AS的高危发病因素;且发现子代动物对高血压及心肌损伤的敏感性增加。此外,国外的流行病学调查也发现暴露于流感大流行出生的人群,其人口在62-82岁的人群中的心血管疾病的发生率较其他人群高出20%以上;另有研究发现,母体的C反应蛋白水平与儿童动脉粥样硬化的发生呈现正相关;孕期母体的高胆固醇血症与子代血管心内膜的形成相关。上述研究强烈提示孕期炎症刺激可能与子代AS的发生相关联。但至今为止,孕期炎症刺激与子代AS的发生有何关系、其可能机制等重要科学问题均待阐明。本实验室前期研究中发现,孕期LPS刺激后子代大鼠血管组织和肾脏组织中促炎细胞因子表达显著增加,呈现出促炎的表型。而免疫系统的发育是从胚胎期10.5天开始出现,表现为主动脉-性腺-中肾区造血干细胞开始进行迁移和分化。结合本研究小鼠孕中期（胚胎期10.5天）给予LPS刺激,且预实验子代小鼠模型出现巨噬细胞和树突状细胞比例增高、子代免疫系统异常改变的发现,我们有理由推测子代免疫系统异常在孕期炎症刺激子代小鼠动脉粥样硬化易感性增加中可能具有重要作用。本研究主要分为两部分实验,第一部分、免疫系统异常在孕期炎症刺激致子代动脉粥样硬化发生的作用及机制:旨在从子代小鼠免疫系统异常的角度出发,探究孕期炎症刺激与子代动脉粥样硬化易感性的关系及其可能分子机制。该研究的结果有望深化和丰富对AS发病机制的认识,并为AS发病新机制的阐明及防治新措施的寻找提供新的思路与理论依据。第二部分、固有免疫NK细胞发育和功能的Tbx21调控研究:本实验室前期研究中发现固有免疫细胞在孕期炎症刺激致子代动脉粥样硬化易感性增加中起到重要的作用。其中,自然杀伤细胞（nature killer cell,NK）是固有免疫细胞中重要的组成细胞,在炎症免疫反应调控中具有关键作用。基于本实验室前期对于NK细胞的研究基础,结合团队其他成员对于NK细胞的发育成熟以及效应性功能的深入研究,为了进一步阐释前期研究中的发现,本部分实验从Tbx21半敲小鼠入手,探究Tbx21半敲在NK细胞发育成熟以及效应性功能的作用。方法和结果:第一部分:1.孕期炎症刺激对ApoE^-/-子代小鼠动脉粥样硬化易感性的影响1.1孕期炎症刺激导致ApoE^-/-子代小鼠主动脉根部斑块面积显著增多成年的雌雄ApoE^-/-小鼠按照2:1合笼交配,合笼次日早晨8:00将合笼的雌雄小鼠分笼,并每天监测体重,根据体重监测结果选出怀孕ApoE^-/-小鼠。怀孕ApoE^-/-小鼠随机分为两组,于胚胎期10.5天分别腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）（75μg/kg）（LPS组）或生理盐水（Con组）,子代小鼠4周龄时,持续给予高脂饮食（High fat diet,HFD）喂养8周,随后进行主动脉根部切片的油红O染色。结果发现,与Con组相比,LPS组子代雄鼠的主动脉根部斑块面积显著增多。雌鼠中也发现与雄鼠类似的趋势。1.2孕期炎症刺激未影响ApoE^-/-子代小鼠血脂水平的进一步升高利用ApoE^-/-小鼠构建孕期炎症刺激模型（详见1.1）。8周高脂饮食喂养结束后,将LPS组和Con组血清分离出来,分别对总胆固醇（Total Cholesterol,TCH）、总甘油三酯（Total Triglyceride,TG）、高密度脂蛋白胆固醇（High-density lipoprotein cholesterol,HDL-c）和低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c）的水平进行检测。结果发现,LPS组与Con组相比,血脂四项指标没有发现显著性差异。2.免疫系统异常对孕期炎症刺激子代动脉粥样硬化易感性的影响2.1孕期LPS刺激对子代小鼠免疫系统的影响成年的雌雄C57BL/6J小鼠按照2:1合笼交配。合笼次日早晨8:00将合笼的雌雄小鼠分笼,并每天监测体重,根据体重监测结果选出怀孕C57BL/6J小鼠。怀孕C57BL/6J小鼠随机分为两组,于胚胎期10.5天分别腹腔注射LPS（75μg/kg）（LPS组）或生理盐水（Con组）。子代小鼠分别位于4周龄和8周龄时,利用流式细胞技术检测脾脏细胞中免疫细胞和免疫细胞功能的改变。固有免疫细胞,包括树突状细胞（Dendritic cell,DC）、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞（Natural killer cell,NK）和中性粒细胞;适应性免疫细胞,包括T淋巴细胞及其亚群、B淋巴细胞的比例。结果发现与Con组相比,孕期炎症刺激（LPS）组4周龄、8周龄子代小鼠脾脏细胞中树突状细胞（Dendritic cell,DC）和巨噬细胞的比例显著增加,单核细胞和调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）的比例显著减少。此外发现,树突状细胞成熟标记物MHCII、CD40、CD86表达显著增高,T细胞活化水平增强,表现为CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺初始T细胞（CD44^-CD62L⁺）比例显著降低,CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺效应T细胞（CD44⁺CD62L^-）比例显著增高。液体芯片检测炎症因子的表达,结果发现LPS组与对照组相比,血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平均显著增高。这提示孕期炎症刺激子代小鼠体内存在促炎的表型。2.2子代免疫系统异常对动脉粥样硬化易感性的影响利用骨髓移植技术将C57BL/6J孕期炎症刺激模型Con组和LPS组8周龄子代小鼠骨髓细胞分离出来,移植到经致死剂量（1000 rads）照射的ApoE^-/-小鼠体内,移植4周后,持续用高脂饮食喂养12周,检测动脉粥样硬化发生的相关指标。结果发现,与对照组(ApoE^-/--Con:孕期炎症刺激Con组子代小鼠骨髓移植到ApoE^-/-受体小鼠)相比,实验组(ApoE^-/--LPS:孕期炎症刺激LPS组子代小鼠骨髓移植到ApoE^-/-受体小鼠)相比,实验组(ApoE^-/--LPS)组主动脉根部斑块面积显著增多,CD68⁺巨噬细胞对血管壁浸润增强。然而,骨髓移植后血脂水平和脂代谢相关基因的水平两组间未见明显差异。我们课题组还利用Ldlr^-/-小鼠作为另一种经典的动脉粥样硬化模型来验证上述结果。同样利用骨髓移植技术将孕期炎症刺激Con组和LPS组8周龄子代小鼠骨髓细胞分离出来移植到经致死剂量（1000 rads）照射的Ldlr^-/-小鼠体内,移植四周后,持续高脂饮食喂养12周,检测动脉粥样硬化发生的相关指标。与对照组(Ldlr^-/--Con)相比,Ldlr^-/--LPS组主动脉根部斑块面积显著增多,CD68⁺巨噬细胞对血管壁浸润增强。表现出与ApoE^-/-小鼠一致的结果。2.3使用氯膦酸二钠的脂质体剂型清除体内树突状、巨噬细胞等细胞对孕期炎症刺激子代免疫系统异常影响动脉粥样硬化易感性的影响氯膦酸二钠被广泛认为是巨噬细胞清除剂。而将氯膦酸二钠构建为脂质体的剂型,可使其具有靶向性、细胞亲和性,提高了氯膦酸二钠的稳定性。氯膦酸二钠脂质体可通过被细胞吞噬,在溶酶体作用下将有效的氯膦酸盐释放出来,从而引起细胞的凋亡。该剂型可最大程度发挥氯膦酸二钠作为巨噬细胞清除剂的作用。我们利用骨髓移植技术将C57BL/6J孕期炎症刺激模型Con组和LPS组8周龄子代小鼠骨髓细胞分离出来,移植到经致死剂量（1000 rads）照射的ApoE^-/-小鼠体内,全程无菌操作,移植4周后,每组分别腹腔注射10μl/g（body weight）剂量的氯膦酸二钠脂质体和相同剂量的空白脂质体,每5天注射一次持续8周,同时伴随高脂饮食的持续喂养。分组为:ApoE-Con+Ct-Lip(孕期炎症刺激Con组子代小鼠骨髓移植到ApoE^-/-受体小鼠,腹腔注射空白对照脂质体);ApoE-LPS+Ct-Lip(孕期炎症刺激LPS组子代小鼠骨髓移植到ApoE^-/-受体小鼠,腹腔注射空白对照脂质体);ApoE-Con+Clod-Lip(孕期炎症刺激Con组子代小鼠骨髓移植到ApoE^-/-受体小鼠,腹腔注射氯膦酸二钠脂质体);ApoE-LPS+Clod-Lip(孕期炎症刺激LPS组子代小鼠骨髓移植到ApoE^-/-受体小鼠,腹腔注射氯膦酸二钠脂质体)。实验结果发现氯膦酸二钠脂质体可有效降低孕期炎症刺激导致的子代小鼠脾脏中异常增高的树突状细胞和巨噬细胞的数量,降低树突状细胞成熟标记物MHCII、CD40、CD86的表达以及CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺效应T细胞（CD44⁺CD62L^-）的比例。此外,氯膦酸二钠脂质体干预后,有效减少了孕期炎症刺激导致的子代小鼠主动脉根部斑块面积的增多,以及CD68⁺巨噬细胞对血管壁的浸润。3.孕期炎症刺激影响子代免疫系统异常的机制研究3.1孕期炎症刺激对子代小鼠造血干/祖细胞以及髓系祖细胞亚群的影响分别将C57BL/6J孕期炎症刺激Con组和LPS组4周龄、8周龄小鼠的骨髓细胞分离出来,利用流式细胞技术检测三种造血干/祖细胞（Hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC）,包括长期造血干细胞（Long-term hematopoietic stem cell,LT-HSC）、短期造血干细胞（Short-term hematopoietic stem cell,ST-HSC）、多潜能祖细胞（Multiple potential progenitor,MPP）以及三种定向祖细胞,包括共同髓系祖细胞（Common lymphoid progenitors,CMP）、粒/单核细胞前体细胞（Granulocytic/monocytic-restricted progenitors,GMP）、巨核细胞/红细胞前体细胞（Megakaryocytic/erythroid progenitors,MEP）的比例和细胞数量。结果发现,与Con组相比,LPS组8周龄骨髓GMP的细胞数量和比例均显著增加,而GMP被认为是树突状细胞、单核巨噬细胞的前体细胞。上述结果提示,HSPC向GMP类细胞的分化的细胞数量增多。3.2孕期炎症刺激对子代小鼠造血干/祖细胞分化能力的影响孕期炎症刺激Con组和LPS组4周龄、8周龄小鼠的骨髓细胞,以及E13.5胎肝细胞分离出来用甲基纤维素培养基进行集落形成实验。相较于Con组,4周龄和8周龄的孕期炎症刺激组小鼠造血干细胞单核吞噬类细胞集落形成单位增多（Colony-forming unit-mononuclear phagocytic system,CFU-M）。此外E13.5胎肝细胞也表现CFU-M集落形成单位增多。上述证据提示HSPC向单核吞噬类细胞分化能力增强。第二部分:1.Tbx21半敲对NK细胞比例以及发育成熟的影响将Tbx21^+/-半敲小鼠与同源的C57BL/6J WT小鼠杂交,子代小鼠于3周龄时剪尾巴进行基因鉴定,根据基因型,将子代小鼠分为WT组和Tbx21^+/-组。子代小鼠8周龄时,利用流式细胞术检测WT组和Tbx21^+/-组小鼠骨髓、脾脏和淋巴结中,NK细胞的比例以及成熟的水平。结果发现,相较于WT组,Tbx21^+/-组小鼠脾脏中NK细胞（CD3^-CD19^-NK1.1⁺）的比例有显著下降。此外,骨髓、脾脏和淋巴结中NK细胞的成熟水平均显著降低。2.Tbx21半敲对NK细胞效应性功能的影响2.1 Tbx21半敲对NK细胞的细胞毒功能的影响首先,利用流式细胞术检测WT组和Tbx21^+/-组小鼠NK细胞分泌细胞因子IFN-γ的水平以及杀伤肿瘤靶细胞的指标CD107a的水平。随后利用流式细胞术检测细胞毒重要指标穿孔素和颗粒酶B的表达水平。实验结果发现,WT组与Tbx21^+/-组小鼠细胞毒功能指标无显著改变。2.2 Tbx21半敲对NK细胞能量代谢的影响利用流式细胞术检测WT组和Tbx21^+/-组小鼠NK细胞代谢能力重要指标CD71、CD98和2-NBDG的水平。实验结果发现,WT组与Tbx21^+/-组小鼠能量代谢相关指标无显著改变。结论:1.孕期炎症刺激导致子代小鼠动脉粥样硬化发病易感性增加;2.子代免疫系统异常是孕期炎症刺激导致子代动脉粥样硬化易感性增加的一个重要原因,采用脂质体剂型的氯膦酸二钠可有效干预本模型下动脉粥样硬化的易感性;3.造血干/祖细胞向GMP细胞的异常分化与孕期炎症刺激导致子代固有免疫系统异常有关。总之,本研究深化和丰富了对AS发病机制的认识,为寻找新的AS有效靶点/治疗措施提供了新的思路,具有重要的意义。