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几丁质是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)通过β-1,4-糖苷键连接而成的高分子聚合物，是仅次于纤维素的第二大可再生资源。几丁质的中间降解产物几丁寡糖是一种具有独特生理活性的功能性低聚糖，分子量小、溶解性好、易于吸收的特性使其在生物医药、食品、化妆品、纺织、农业等各领域都有广泛的应用价值。与国外相比，我国对几丁质酶水解几丁质得到几丁寡糖的研究起步较晚，且其酶活力不高，不能满足产业化要求，因此提高几丁质酶的水解活力具有非常大的意义。
本课题组己完成了以大肠杆菌表达系统克隆表达绿色木霉内切几丁质酶基因的工作。本课题以该基因作为起始材料，通过定向进化策略和高通量筛选手段提高了内切几丁质酶的活力；对高活力突变株的发酵培养基进行优化；对重组蛋白进行表达、纯化并研究其酶学性质。主要研究结果如下所述：
利用易错PCR技术，以重组质粒pET-28a(+)-MECHs为模板构建突变体库，用于高通量筛选。从原始菌株BL21/pET-28a(+)-MECHs出发经过一轮定向进化，筛选得到突变菌株MECH118，其酶活是原始菌株的1.81倍。测序结果表明，目的基因有9个碱基发生了突变：G69A, T276C, C300T, A554T, T676C, A1002G, T1168A, A1169G, G1170C。由此导致氨基酸序列第185位酪氨酸突变为苯丙氨酸Y185F，第226位丝氨酸突变为脯氨酸S226P。
采用两水平部分因子实验设计研究了发酵培养基各组分对内切几丁质酶比活力的影响，得出主要影响因子为Na2HPO4·12H2O、KH2PO4和葡萄糖。三者在95％的概率水平上对菌体产酶都有正效应。然后采用BBD确定各主要影响因子的最佳作用浓度，得到优化的发酵培养基组成(g/L): Na2HPO4·12H2O16.8, MgSO4·7H2O0.14, NH4C11, KH2PO42，蛋白胨14，葡萄糖8.8，酵母粉6。在优化发酵培养基中供试菌株的比活力是未优化发酵培养基中的1.67倍。
发酵液经硫酸铵盐析、DEAE-52阴离子交换层析和SephadexG-100凝胶层析得到电泳纯内切几丁质酶。结果表明，粗酶液比活力从0.537×10-3(U/mg)提高到5.194×10-3(U/mg)，纯化倍数为9.67倍，回收率为8.1％。同时SDS-PAGE电泳结果显示，经各步纯化操作得到一条单一的蛋白条带，作图法求得该酶的分子量为46.77kD。
对纯化后内切几丁质酶的酶学性质进行研究，在pH7.0和37℃反应条件下，该酶水解底物PNPG的Km值为0.2514mmol/L，最大反应速度Vmax为4.5872μmol/L·min-1。与优化前所产几丁质酶比较，优化后酶的最适反应温度仍为60℃，但热稳定性下降；最适反应pH为7.4，比优化前略小。对比9种不同金属离子对优化后酶的活性影响，Mn2+、Mg2+和Ba2+对该酶有比较明显的激活作用，Zn2+、Cu2+和Co2+对该酶有明显的抑制作用，而Na+、K+和Ca2+对该酶则无明显的作用。