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目的:氟是一种人体必需微量元素,适量氟能够维持机体正常生理功能,过量氟则会引起氟中毒。流行病学调查显示,高氟地区儿童骨龄延迟,身高、体重、胸围均低于正常同龄儿童。本课题组前期动物实验和器官培养实验发现氟通过抑制软骨内成骨过程损害长骨纵向生长。软骨内成骨是骨形成的主要方式,此过程受到全身激素、细胞因子和局部产生的信号因子共同作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种广泛存在于生物细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞生长、增殖、分化、存活和自噬的中心调控因子。然而,氟是否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制软骨内成骨尚未见报道。为此,我们通过体外器官培养胚胎大鼠胫骨和体外培养源于畸胎瘤细胞的小鼠软骨发生细胞ATDC5细胞模拟软骨细胞分化,观察氟是否通过调控PI3K/AKT/m TOR信号通路抑制软骨细胞的增殖和分化。本研究为阐明氟抑制长骨生长的机制提供线索,为氟骨症的防治提供依据。实验方法:本研究选取胚胎第20天的胎鼠胫骨,采用左右配对的方法分为两组,左侧胫骨为对照组,右侧胫骨为染氟组(10-4M NaF),培养于含0.2%牛血清蛋白、0.05mg/ml Vc、1m Mβ-甘油磷酸钠的α-MEM培养基中。7天后,胫骨经固定、石蜡包埋并切片,免疫组织化学方法检测胫骨PCNA和p-S6的蛋白表达,观察氟对软骨细胞增殖和mTOR活性的影响。ATDC5细胞培养于含有5%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素和1?ITS的DMEM培养基中,分别予以染氟3、5、7、14和21天。采用CCK8方法检测ATDC5细胞活力并在倒置显微镜下观察细胞形态的变化;阿利新蓝染色检测聚集蛋白多糖(Aggrecan)的合成及软骨结节的形成情况;Western blot和实时荧光定量PCR分别检测软骨细胞分化相关基因(Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X)和PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因(PI3K、AKT、mTOR、S6K1、4EBP1、LC3II/I、Beclin1、P62)的mRNA和蛋白表达,应用m TOR激动剂MHY1485和mTOR抑制剂Rapamycin,探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路在氟致软骨损伤中的作用。结果:1.氟对胫骨软骨细胞增殖和m TOR活性的影响:染氟组胫骨中PCNA和p-S6阳性细胞率显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.氟对小鼠ATDC5细胞活力及细胞形态的影响:染氟浓度为10-3M时,细胞活力显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.001);对照组细胞生长状态良好,基本保持着原有的细胞结构;染氟组细胞培养液内细胞碎片颗粒物增多,细胞生长缓慢,收缩变形,多伪足。3.氟对小鼠ATDC5细胞分化的影响:在ITS的作用下,ATDC5细胞快速增殖融合成单层,融合后的细胞形成软骨结节,软骨结节形态随培养时间增加逐渐扩大,软骨结节数量逐渐增多;对照组细胞阿利新蓝染色强度随培养时间增加而增强,染氟组细胞染色强度低于对照组、软骨结节数量少于对照组;与对照组比较,染氟组细胞Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X mRNA表达和Sox9、Col II蛋白表达均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.氟对软骨细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响:染氟组细胞mTOR、S6K1和4EBP1 mRNA表达和PI3K、AKT、mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达均显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.氟对ATDC5细胞自噬相关基因表达的影响:与对照组相比,染氟组细胞Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表达显著增加,P62蛋表达白显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.mTOR激动剂MHY1485上调氟抑制的p-mTOR、p-S6K1和p-4EBP1的表达:染氟组细胞中mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显著低于对照组,mTOR激动剂MHY1485组中细胞mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显著高于对照组。染氟+m TOR激动剂MHY1485组细胞mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显著高于染氟组,差异具均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,染氟+mTOR激动剂MHY1485组细胞中mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达无明显差异,mTOR抑制剂Rapamycin组细胞中mTOR,S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.氟通过抑制mTOR的磷酸化诱导ATDC5细胞自噬:与对照组比较,染氟组细胞中P62的蛋白表达显著下调,mTOR激动剂MHY1485组细胞中P62的蛋白表达显著上调。与染氟组比较,染氟+m TOR激动剂MHY1485组细胞中P62的蛋白表达显著上调,差异具均有统计学意义(P<0.05)。Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表达结果与P62的蛋白表达结果相反。与对照组比较,染氟+m TOR激动剂MHY1485组细胞中P62,Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表达无显著差异。mTOR抑制剂Rapamycin组细胞中P62蛋白表达显著下调,Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表达显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。8.氟通过下调m TOR的磷酸化抑制ATDC5细胞分化:染氟组细胞中Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表达显著低于对照组,mTOR激动剂MHY1485组细胞中Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表达显著增加。染氟+mTOR激动剂MHY1485组细胞Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表达显著高于染氟组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,染氟+mTOR激动剂MHY1485激动剂组细胞分化相关基因mRNA表达均无显著差异。mTOR抑制剂Rapamycin组中Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表达显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05),Sox9和Col II的蛋白表达结果与mRNA表达结果一致。结论:1.氟下调PI3K/AKT/m TOR信号通路,抑制其下游因子S6K1和4EBP1的磷酸化,进而抑制软骨细胞增殖和分化。2.氟下调PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进软骨细胞自噬的发生。