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目的:COX-2(环氧合酶-2,cyclooxygenase-2)在肿瘤细胞中高表达,被作为肿瘤标志物。目前研究已发现COX-2在肿瘤细胞中有多种启动子结合蛋白,这些调控因子如何差异性地与COX-2启动子结合,调控COX-2表达及参与肿瘤形成的具体分子机制尚不明确。本研究通过启动子结合蛋白垂钓鉴定系统,并且联合蛋白质组学质谱技术,鉴定能够与COX-2启动子区相结合的蛋白,并鉴定出其中之一为hn RNPA2/B1(核不均一核糖核蛋白A2/B1,heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1)。进一步,为了明确hn RNPA2/B1对COX-2的调控机制及生物学功能,选择不同肺癌细胞系,敲低或过表达hn RNPA2/B1之后,探索hn RNPA2/B1对COX-2的表达调控,COX-2启动子驱动的活性,并分析hn RNPA2/B1对COX-2下游产物的影响;为了在裸鼠体外成瘤模型中验证hn RNPA2/B1调控COX-2与细胞学实验中的机制研究结果一致,对成瘤的裸鼠进行hn RNPA2/B1 si RNA治疗后,动态观察裸鼠肿瘤体积大小及体重的变化,使用裸鼠肿瘤组织检测hn RNPA2/B1与COX-2表达的相关性;最后,通过对临床标本中hn RNPA2/B1和COX-2在肺癌细胞和正常癌旁组织中的表达情况,分析hn RNPA2/B1与COX-2表达的相关性,分析高表达hn RNPA2/B1和COX-2的患者预后因素,评估其与肺癌分期、生存、转移、复发等的相关性。深入研究hn RNPA2/B1对COX-2表达调控的分子机制及明确hn RNPA2/B1的临床意义。旨在确立hn RNPA2/B1/COX-2作为肺癌治疗新靶点提供理论和实验依据。方法:使用DNA结合蛋白垂钓方法(Biotin-Streptavadin-Agarose Pulldown),联合蛋白质组学质谱技术,蛋白鉴定hn RNPA2/B1与COX-2启动子特异性结合。在非小细胞肺癌细胞系A549,H322,H460,H1299中,使用染色质免疫共沉淀CHIP及Pull down方法验证hn RNPA2/B1与COX-2启动子区结合。在非小细胞肺癌细胞系及肺癌组织中,使用Western blot,RT-PCR及免疫组化检测hn RNPA2/B1,COX-2等表达情况。选取H460或H1299肺癌细胞系敲低或高表达hn RNPAB之后,用RT-PCR、Western Blot检测在转录水平及翻译水平COX-2的变化,ELISA方法检测细胞培养基中PGE2含量,用荧光报告基因检测hn RNPA2/B1对COX-2启动子活性的影响,用划痕实验检测细胞迁移能力,用MTT实验检测细胞增殖及细胞活力。使用免疫共沉淀Co-IP检测蛋白之间的相互作用,并在hn RNPA2/B1过表达的情况下敲低p300表达或阻断p300活性,以及在p300过表达的情况下敲低hn RNPA2/B1,观察二者对于COX-2表达和肺癌细胞增殖的协同调控。建立肺癌的小鼠皮下移植肿瘤模型,观察不同组别之间裸鼠肿瘤形成和生长速度,评价使用hn RNPA2/B1 si RNA对裸鼠肿瘤治疗的疗效。采用组织芯片、免疫组化、Western Blot等技术检测肺癌组织和正常癌旁组织标本中hn RNPA2/B1和COX-2的表达水平,结合临床资料,使用统计学软件SPSS分析hn RNPA2/B1和COX-2表达与肺癌的分期、转移、复发、生存等因素的相关性,并评估它们在肺癌临床诊断、预测预后、转移复发上的价值和意义,以期确定它们作为新型的肺癌分子标记和治疗靶点。结果:1.在肺癌细胞系A549,H1299,H322,H460及非正常细胞系HLF中,发现并验证了hn RNPA2/B1为特异性的COX-2启动子结合蛋白。2.在肺癌细胞系H460及H322中,敲低hn RNPA2/B1后,COX-2转录水平、蛋白表达及前列腺素E2(PGE2)合成减少,COX-2启动子区活性降低。3.在肺癌细胞系H1299,H460及H322中,过表达hn RNPA2/B1后,COX-2转录水平、蛋白表达及前列腺素E2(PGE2)合成增加,COX-2启动子区活性升高。4.在肺癌细胞系H460中,敲低hn RNPA2/B1后,细胞迁移能力下降,细胞形态皱缩、变小、发亮。5.在小鼠皮下注射H460肺癌细胞系的成瘤模型实验中,裸鼠经过hn RNPA2/B1si RNA治疗之后的si RNA组,肿瘤体积及重量均小于对照组(定点注射Ctrl si RNA)。裸鼠经过si RNA治疗之后腹腔注射脂多糖LPS诱导全身炎症的实验组裸鼠肿瘤与对照组(定点注射Ctrl si RNA)相比,肿瘤体积及重量未见明显变化。6.采用组织芯片、免疫组化、Western Blot等技术检测肺癌组织和正常癌旁组织,hn RNPA2/B1及COX-2在肺癌细胞系及肺腺癌组织中高表达。结合临床资料,使用统计学软件SPSS分析hn RNPA2/B1和COX-2表达与肺癌的TNM分期密切相关,与淋巴结转移、复发等因素无相关性。hn RNPA2/B1及COX-2同时高表达的患者预后差。提示hn RNPA2/B1为肺癌分子标记物,hn RNPA2/B1/COX-2为临床肿瘤治疗新靶点。7.在肺癌细胞系A549,H1299,H460中,hn RNPA2/B1可以与p300相互作用。过表达p300可以促进hn RNPA2/B1的乙酰化,从而加强hn RNPA2/B1与COX-2启动子区结合,促进COX-2转录活性、蛋白表达、PGE2产生、COX-2启动子活性及肿瘤细胞活力。结论:在非小细胞肺癌中,hn RNPA2/B1可以特异性的直接与COX-2启动子区结合,通过与p300相互作用,协同调控COX-2转录活性及蛋白表达,上调COX-2启动子活性、PGE2合成,促进肿瘤细胞生长、肿瘤体积大小及重量。统计临床标本发现hn RNPA2/B1及COX-2同时高表达患者预后差,提示hn RNPA2/B1/COX-2通路可能作为肺癌治疗的新靶点。