论文部分内容阅读
外周血液中的循环肿瘤细胞,虽然被人们视作肿瘤诊断十分理想的生物标志物,但由于其在血液中的含量极其微小(1毫升血液中往往只存在几十个甚至几个循环肿瘤细胞),使得人们迫切需要开发出一种高效、可靠以及高通量的循环肿瘤细胞分离富集平台。本文以人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)为目标细胞,人B淋巴细胞瘤细胞(Ramos)为对照细胞,将微流控芯片技术与核酸适配体探针结合起来,实现了对CCRF-CEM细胞的高效捕获。主要研究内容包括:1.微流控芯片的构型及其对肿瘤细胞捕获效率影响的考察。通过实验发现,使用氢氟酸对芯片玻璃基片的简单粗糙化处理,能够显著提高目标细胞的捕获效率。本部分研究解决了微流控芯片构型的选择以及结构的改进,证实了芯片捕获肿瘤细胞的可行性,优化了氢氟酸对芯片玻璃基片表面粗糙化处理的条件。确定使用10%氢氟酸对玻璃基片表面自然腐蚀60s时为最佳。且在相同的实验条件下,通过粗糙化处理的芯片对于未处理的芯片,捕获效率能有10%左右的提高。2.核酸适配体探针的使用方式及其对肿瘤细胞捕获效率影响的考察。传统的细胞捕获技术一般是将捕获探针固定于芯片通道内,这样就会由于探针间空间位阻的影响,制约捕获效率的提高。本部分工作采用游离探针法,即首先将亲和素修饰在通道基底表面,接着使用游离的生物素化核酸适配体探针与目标细胞在均相中先行结合,再通入芯片,利用生物素-亲和素反应进行捕获。发现在相同的实验条件下,游离探针法的捕获效率能提高5%左右。并且在此部分对样品通入芯片的流速、核酸适配体探针的浓度、核酸适配体探针与目标细胞混合孵育时间等条件进行了优化,确定在缓冲液中捕获目标细胞的最佳实验条件为,流速为3mL/h,核酸适配体探针浓度为1μM,及探针与目标细胞的孵育时间为7min。在最优条件下考察了芯片对于细胞的选择性,以及不同浓度目标细胞的捕获效率。3.人全血样本中肿瘤细胞捕获效率的考察。能够在人全血样本中实现对于微量肿瘤细胞的捕获,是本研究的主要目的。但由于人全血样本与缓冲液有非常大的差别,考察了全血中大量的血细胞对捕获效率的影响。并针对这些影响,对人全血样本的流速以及核酸适配体探针的浓度进行优化,确定了流速为1mL/h,核酸适配体探针浓度为1.5μM时最佳。还考察了在血清以及人全血样本中不同浓度目标细胞的捕获效率,实现了在目标细胞浓度为100cells/mL的人全血样本中,捕获效率达到99%。