第一部分IVF刺激周期中注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮浓度对胚胎着床率的影响目的：已知注射hCG日孕酮浓度对IVF胚胎着床率有预测价值,然而,注射hCG次日的血清孕酮浓度对IVF胚胎着床率是否也有预测价值呢?与注射hCG日孕酮浓度相比,其预测价值相对较低?相同?或更高?方法：本研究为单中心、回顾性、观察性队列研究。研究对象为自2011年1月～2013年5月间于浙江大学医学院附属邵逸夫医院生殖中心接受IVF治疗的全部5828个卵巢刺激周期的临床资料。研究期间,本中心的鲜胚移植策略：仅患者获卵数≤15枚,注射hCG日孕酮≦2.0ng/ml,且无卵巢过度刺激(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)倾向等条件均同时满足的前提下,方可进行新鲜胚胎移植。否则,建议患者全部新鲜胚胎冷冻,择期行冻融胚胎移植。研究期间,所有患者均于注射hCG日及注射hCG次日清晨采取血样检测血清雌二醇浓度和孕酮浓度。研究期间均使用同样的血清性激素检测试剂盒,无临床或胚胎实验室治疗方案变动。研究期间本中心的胚胎着床率和临床妊娠率均维持在稳定水平。为研究注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮浓度与胚胎着床率之间的关系,全部1457个IVF新鲜胚胎移植周期纳入进一步研究。以胚胎着床率为因变量,通过多因素逐步回归分析的方法,分析下列因素：年龄,获卵数,注射hCG日子宫内膜厚度,注射hCG日雌二醇水平,注射hCG日孕酮水平,注射hCG次日雌二醇水平,注射hCG次日孕酮水平,注射hCG日孕酮与注射hCG次日孕酮之和,总rFSH用量,总rFSH刺激天数,移植胚胎数,移植优质胚胎数,与胚胎着床率之间的关系。根据2011年-2013年间本中心的5828个IVF刺激周期注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮浓度数据,将孕酮浓度“升高”定义为孕酮值高于整体孕酮值分布的90%百分位数,未能达到此标准则定义为孕酮浓度“正常”。进一步将这1457个新鲜胚胎移植周期根据注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮浓度正常或升高分为4组：NN组,注射hCG日及注射hCG次日孕酮浓度均正常；NH组,注射hCG日孕酮浓度正常但注射hCG次日孕酮浓度升高；HN组,注射hCG日孕酮浓度升高但注射hCG次日孕酮浓度正常；HH组,注射hCG日及注射hCG次日孕酮浓度均升高,进行临床各指标及胚胎着床率和临床妊娠率的组间比较。结果：1.根据5828个IVF刺激周期注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮浓度数据,注射hCG日孕酮平均水平为1.4±0.8ng/ml,注射hCG次日孕酮水平显著增加7.9±5.5ng/ml(P<0.001)。2.注射hCG后12小时,血清孕酮浓度较注射hCG之前的孕酮浓度相比,上升>5倍。3.根据5828个IVF刺激周期注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮浓度数据,注射hCG日孕酮正常或升高的cut-off值为1.7ng/ml；注射hCG次日孕酮正常或升高的cut-off值为9.5ng/ml。4.多因素逐步回归分析结果显示,年龄、获卵数、注射hCG日孕酮和注射hCG次日孕酮之和为3个显著影响胚胎着床率的因素。若将注射hCG日孕酮和注射hCG次日孕酮之和从自变量列表中剔除,则注射hCG次日孕酮被回归方程选择为第三个显著影响胚胎着床率的因素；若进一步将注射hCG次日孕酮也从自变量列表中剔除,则注射hCG日孕酮被回归方程选择为第三个显著影响胚胎着床率的因素。5.1457个新鲜胚胎移植周期根据注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮浓度正常或升高分为4组后比较发现：与NN组相比,HH组患者显著更年轻(31.9±4.6岁&29.7±3.5岁,P<0.001),基础FSH更低(8.1±1.9IU/L&7.9±1.2IU/L,P<0.05),获卵数更多(7.9±4.0个&12.7±3.3个,P<0.001),胚胎数更多(5.3±3.0个&6.7±2.6个,P<0.001),移植胚胎数/移植周期无显著差别(1.8±0.4个&1.8±0.4个),移植优质胚胎数/移植周期差别无统计学意义(1.6±0.5个&1.7±0.5个),但胚胎着床率却显著低下(36.0%&22.2%,P<0.001,),临床妊娠率也显著低下(59.7%&37.5%,P<0.001)。结论：临床工作中决定是否进行全部胚胎冷冻时,不应仅关注注射hCG日血清孕酮浓度,还应结合考虑注射hCG次日的血清孕酮浓度。第二部分IVF刺激周期中注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮浓度对着床期内膜形态学和uNK细胞数目的影响目的：IVF刺激周期中注射hCG日及注射hCG次日的高血清孕酮浓度,是否影响着床期子宫内膜的形态变化?以及uNK细胞的数目?方法：本研究为单中心,前瞻性队列研究。研究对象选自2013年7月～2013年12月间于浙江大学医学院附属邵逸夫医院生殖中心接受IVF治疗的119名患者。研究期间,本中心的鲜胚移植策略：仅患者获卵数≦15枚,注射hCG日孕酮≦2.0ng/ml,且无卵巢过度刺激(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)倾向等条件均同时满足的前提下,方可进行新鲜胚胎移植。否则,建议患者考虑全部新鲜胚胎冷冻,择期行冻融胚胎移植。119名患者均按照本中心已建立的新鲜胚胎移植策略选择进行全部胚胎冷冻。取卵术后按本中心常规黄体支持方案给予肌注黄体酮,于注射hCG+7天通过一次性宫腔组织吸引管取少量内膜组织行形态学分析和uNK细胞数目检测。内膜组织学评分由两位有经验的观察者依据Noyes等(1950)建立的标准按照盲法独立完成；uNK细胞计数由两位观察者独立完成。均进行观察者间差异评估。119名患者均于注射hCG日及注射hCG次日的清晨采取血样检测血清雌二醇浓度和孕酮浓度。分别通过多因素逐步回归的方法分析下列因素：注射hCG日孕酮浓度,注射hCG次日孕酮浓度,注射hCG日雌二醇浓度,注射hCG次日雌二醇浓度,rFSH刺激时间,与内膜组织学评分结果和uNK细胞数目的关系。根据2011年-2013年间本中心的5828个IVF刺激周期注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮浓度数据,将孕酮浓度“升高”定义为孕酮值高于整体孕酮值分布的90%百分位数,未能达到此标准则定义为孕酮浓度“正常”。由此,注射hCG日孕酮正常或升高的cut-off值为1.7ng/ml；注射hCG次日孕酮正常或升高的cut-off值为9.5ng/ml。进一步进行了内膜组织学评分结果、腺体-基质发育不同步比例和uNK细胞数目在孕酮正常组和孕酮升高组的组间比较。结果：(注射hCG日和注射hCG次日血清高孕酮浓度与内膜形态学变化之间的关系)1.多因素逐步回归分析结果显示：注射hCG次日血清孕酮浓度为唯一显著影响内膜组织学评分结果的因素。2.将119例样本根据注射hCG次日血清孕酮浓度正常或升高(cut-off值：9.5ng/m1)分为两组：观察者1结果：与孕酮正常组(7.6±0.7天)相比,孕酮升高组的内膜发育更为成熟(8.0±0.6天),差异显著(P<0.001,)；观察者2结果：与孕酮正常组(6.8±1.0天)相比,孕酮升高组的内膜发育更为成熟(7.6±0.8天),差异显著(P<0.001)。3.两位观察者所提供的组织学评分结果具有很显著的相关性(r=0.394,P<0.001)。整体来讲,70%的结果差异于1天之内,95%的结果差异于2天之内。4.孕酮正常组中腺体-基质发育不同步(腺体-基质成熟天数相差≧4天)的样本比例约为～51%,显著(P<0.001)高于孕酮升高组中腺体-基质发育不同步所占的样本比例22%。(注射hCG日和注射hCG次日血清高孕酮浓度与内膜uNK细胞数目之间的关系)5.多因素逐步回归分析结果显示：注射hCG日血清孕酮浓度为唯一显著影响内膜uNK细胞数目的因素。6.两位观察者uNK计数的结果显著相关(r=0.9,P<0.05),uNK细胞计数的平均差异值为2.4%(±3.3%)。7.将119例样本根据注射hCG日血清孕酮浓度正常或升高(cut-off值：1.7ng/m1)分为两组：孕酮升高者内膜的uNK细胞数目9.2%(1.3-21.6%)(中位数(范围))显著(P<0.001)高于孕酮正常者的内膜uNK细胞数目6.3%(1.4-18.7%)。结论：IVF刺激周期中注射hCG日及注射hCG次日血清高孕酮促使着床期内膜发育更为成熟,uNK细胞数目显著增加。第三部分IVF刺激周期中注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮浓度对着床期内膜基因表达谱的影响目的：研究IVF刺激周期中注射hCG日及注射hCG次日血清高孕酮对着床期内膜基因表达谱的影响,本部分研究尤其关注的问题是,参与uNK细胞生成及功能调节的相关基因的表达,在多大程度上受到了高孕酮浓度的影响?方法：本研究为单中心,前瞻性队列研究。研究对象选自2013年7月～2013年12月间于本生殖中心接受IVF治疗的12名患者。这12名患者均按照本中心已建立的鲜胚移植策略进行全部胚胎冷冻。取卵后按照本中心常规黄体支持方案肌注黄体酮,于注射hCG+7天通过一次性宫腔组织吸引管取少量内膜组织行基因芯片实验和组织形态学分析。12名患者均于注射hCG日及注射hCG次日的清晨采取血样检测血清雌二醇浓度和孕酮浓度。根据2011年-2013年间本中心的5828个IVF刺激周期注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮浓度数据,将孕酮浓度“升高”定义为孕酮值高于整体孕酮值分布的90%百分位数,未能达到此标准则定义为孕酮浓度“正常”。由此,注射hCG日孕酮正常或升高的cut-off值为1.7ng/ml；注射hCG次日孕酮正常或升高的cut-off值为9.5ng/ml。根据注射hCG日孕酮浓度和注射hCG次日孕酮浓度正常或升高,12名患者可分为4组：组1(NN),注射hCG日和注射hCG次日孕酮均正常；组2(NH),注射hCG日孕酮正常但注射hCG次日孕酮升高；组3(HN),注射hCG日孕酮升高但注射hCG次日孕酮正常；组4(HH),注射hCG日和注射hCG次日孕酮均升高。组间比较表达差异≧2倍,且P<0.05被选择为显著差异表达基因。分别依次进行组间显著差异表达基因的比较：组4(HH)与组1(NN)比较,组3(HN)与组1(NN)比较,以及组2(NH)与组1(NN)比较。分别将各组间比较所获得的显著差异表达基因列表向DAVID(基因功能分析网站)提交,通过DAVID提供的KEGG pathway功能进行差异表达基因的相关功能分析。根据组4(HH)与组1(NN)比较获得的153个显著差异表达基因,对12个样本进行聚类分析。选择8个基因进行qRT-PCT验证。这8个基因中,4个基因选自NK细胞介导细胞毒作用通路中表达异常的基因,包括CD247分子(Cd247),杀伤细胞瘦素样受体超家族C,成员2(KLRC2),杀伤细胞瘦素样受体超家族D,成员1(KLRD1),自然细胞毒作用触发受体1(NCR1),另4个基因包括：水通道蛋白-3(AQP3),富含亮氨酸重复因子1(LRRC1),基质金属蛋白酶(MMP26),和钙结合蛋白S100P。结果：1.4组患者年龄、基础内分泌、注射hCG日雌二醇水平、注射hCG次日雌二醇水平、rFSH刺激时间、获卵数等各临床指标差异均无统计学意义。2.组4(HH)与组1(NN)比较共153个基因表达差异显著,DAVID KEGG pathway分析结果显示4条pathway受到显著影响,按照受影响程度从大到小依次排序为：NK细胞介导的细胞毒作用(15个基因表达失调),抗原表达和提呈(6个基因表达失调),移植物宿主相关疾病(6个基因表达失调),和淀粉和糖代谢(6个基因表达失调)。3.组3(HN)与组1(NN)的pathway分析结果显示3条pathway受到显著影响,按照受影响程度从大到小依次排序为：细胞周期(8个基因表达失调),剪接体(7个基因表达失调),NK细胞介导的细胞毒作用(7个基因表达失调)。4.组2(NH)与组1(NN)的pathway分析结果显示5条pathway受到显著影响,根据受影响程度从大到小依次为：细胞周期(7个基因表达失调),剪接体(7个基因表达失调),NK细胞介导的细胞毒作用(7个基因表达失调),wnt信号转导通路(7个基因表达失调),和抗原表达和提呈(5个基因表达失调)。5.注射hCG日和注射hCG次日两天内,只要有一天的孕酮浓度升高,NK细胞介导的细胞毒作用通路均受到显著影响；若两天的孕酮浓度均升高,NK细胞介导的细胞毒作用通路成为受影响最为显著的一条pathway(P<0.0001)。6.组4(HHH)与组1(NN)比较时,15个NK细胞介导的细胞毒作用pathway中表达差异显著的基因分别为：杀伤细胞瘦素样受体超家族C,成员2(KLRC2,上调3.2倍)；杀伤细胞瘦素样受体超家族C,成员3(Klrc3,上调2.2倍)；杀伤细胞瘦素样受体超家族D,成员1(KLRD1,上调3.4倍)；杀伤细胞瘦素样受体超家族K,成员1(KLRKl,上调2.4倍)；自然细胞毒触发受体1(Ncrl,上调3.1倍)；颗粒酶B (GZMB,上调2.4倍)；血细胞生成信号转导因子(HCST,上调2.5倍)；Fc fragment of IgG,低亲合力Ⅲa,受体(CD16a)(Fcgr3a,上调2.3倍)；CD247分子(Cd247,上调2.3倍)；Fc fragment of IgE,高亲合力I, gamma多肽受体FCER1G,上调2.8倍)；TYRO酪氨酸激酶结合蛋白(TYROBP,上调2.6倍)；穿孔素1(Prf1,上调2.4倍)；ras-相关C3肉毒杆菌毒素底物2(rho家族,小GTP结合蛋白Rac2)(rac2,上调2.3倍)；杀伤细胞瘦素样受体超家族C,成员1(Klrcl,上调3.2倍)；肿瘤坏死因子(配体)超家族,成员10(TNFSF10,下调2.4倍)。7.根据组4(HH)与组1(NN)比较得到的153个差异表达基因,对12个样本的聚类结果显示,4组患者的基因表达谱各不相同,其中,组2(NH)和组3(HN)的基因表达谱相对较为相似。8. CD247, KLRC2, KLRD1, NCR1, AQP3, LRRC1, MMP26, S100P的qPT-PCR验证结果均与芯片结果一致。结论：1.注射hCG日孕酮浓度和注射hCG次日孕酮浓度均可影响着床期内膜基因表达谱的改变。2.IVF刺激周期注射hCG日及注射hCG次日高孕酮对着床期子宫内膜的影响可能是通过其对uNK细胞的作用来实现。