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本文对人隐孢子虫的分离和检测及其抗原P23表位疫苗的构建进行了研究。文章主要包括五个部分：①人隐孢子虫的分离和鉴定；②C．hominis的RT-PCR—ELISA检测方法的建立；③C．hominis粘附蛋白P23基因的克隆、表达及免疫活性的研究；④采用噬菌体展示技术对人隐孢子虫P23抗原细胞表位的筛选；⑤P23抗原表位疫苗的构建与表达。
⑴将形态学手段和分子生物学方法相结合，对猴源隐孢子虫进行了分离和鉴定。采用饱和蔗糖漂浮法对粪便中的卵囊进行分离，所分离的卵囊经改良抗酸染色和荧光显微镜进行形态学鉴定。采用梯密度离心法对所分离的卵囊进行纯化，纯化后的卵囊用于基因组DNA和总RNA的提取，分别采用PCR方法和RT-PCR方法扩增卵囊壁蛋白(oocyst wall protein，COWP)基因、18S rRNA基因和钙调蛋白激酶(CalK)基因，扩增的产物克隆到PMD—18-T载体中，对经鉴定为阳性的克隆进行测序，所得序列加以比对和作进化树分析。结果表明：(1)在形态学方面，光学显微镜下观察所分离的卵囊大小为4.6—5.2×3.7—4.0μm，卵囊壁薄，内有四个子孢子，且有折光现象。经抗酸染色后，卵囊呈玫瑰红色，形状规则，似圆形或椭圆形。在荧光显微镜下观察到的卵囊为一圆形亮点，中央呈现乳白色荧光，卵囊壁周围略深染，似环状。观察结果表明所分离的卵囊与C． hominis的形态学特征相一致。(2)分子鉴定方面，PCR扩增产物经电泳检测后，发现分别有554bp、370bp和2034bp大小片段被扩增出，与预期结果一致。所得序列测定后经Blast分析，发现所扩增的卵囊壁蛋白(COWP)基因和18S rRNA基因序列与GenBank中登陆的C．hominis OWP基因和18SrRNA基因同区域序列的同源性均为100％，所扩增的钙调蛋白激酶(CalK)基因与GenBank中C．hominis CalK基因(XM_661216.1)同源性为99％。分别对三个基因作进化树分析，结果表明从分离的卵囊中扩增的三个基因在遗传距离上均与C．hominis最近。由此可认为本实验中从猴粪便中分离出的隐孢子虫为C．hominis。
⑵根据GenBank中登陆的C．hominis粘附蛋白P23基因序列，并与其他种的隐孢子虫同一基因序列进行多重比对，设计一对引物(其中p1引物带有生物素标记)用来扩增含高变区目的片段，同时在高变区内设计一条带有地高辛标记用于杂交的探针引物。采用RT-PCR方法扩增目的片段，扩增产物与探针引物进行液相杂交，然后将杂交产物与微孔板上包被的链霉亲和素结合，再与辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体反应，最后加入酶底物进行显色，建立C．hominis的RT-PCR—ELISA方法，使用临床22份样本对所建立的检测方法作一验证，并将之与常规检测方法进行比较。结果表明：所建立的RT-PCR—ELISA检测方法具有高特异性和敏感性，比常规的PCR方法灵敏度提高了60多倍。临床样本检测显示，该方法的检出率高达82％(18/22)，而RT-PCR、蔗糖漂浮和抗酸染色方法的检出率仅为27％(6/22)、27％(6/22)和50％(11/22)，表明该方法的敏感性最高。
⑶采用基因重组技术，对猴源C．hominis P23抗原基因进行克隆，构建重组质粒pGex—4T-P23，并转化到宿主菌大肠杆菌Rossetta中进行表达，工程菌经超声波破碎，按萨姆布鲁克(2002)方法对重组表达蛋白进行纯化，SDS-PAGE电泳检测表达和纯化效果。采用淋巴细胞转化试验检测重组蛋白对鼠脾脏淋巴细胞增殖情况；采用Dot—ELISA方法检测其与抗体反应特性。结果表明：(1)成功地克隆出C．hominis粘附蛋白P23基因，该序列中包含了一个完整的阅读框，可用于重组蛋白表达。(2)SDS-PAGE检测结果显示，重组质粒在大肠杆菌Rossetta中经IPTG诱导后，明显有40 kD左右目的蛋白表达，与预期结果一致。(3)体外淋巴细胞转化试验进一步证实：重组抗原P23能够刺激未经隐孢子虫感染的鼠脾脏淋巴细胞增殖，用1μg，5μg和10μg重组表达蛋白P23均能刺激鼠脾脏淋巴细胞增值，与阴性对照相比，差异显著(p<0.05)；与阳性对照相比，差异不显著(p>0.05)。但对1μg重组表达蛋白P23刺激鼠脾脏淋巴细胞增殖与5μg和10μg用量的刺激增值能力相比较，其刺激能力较弱，差异显著(p<0.05)。(4) Dot—ELISA试验结果表明重组表达P23抗原能够与感染C．hominis的猴血清中的抗体发生反应，反应效果明显。
⑷以制备抗重组P23抗原的IgG为靶标，采用噬菌体随机7肽库进行3轮生物淘选。用ELISA和免疫印迹方法鉴定重组噬菌斑特异性，对鉴定为阳性的噬菌斑克隆进行DNA测序，推导表位序列。运用生物信息学方法对所得序列进行抗原指数、亲水性、二级结构等分析。结果表明靶标与噬菌体结合后，经3轮筛选，ELISA鉴定共获得了10个阳性噬菌斑克隆。对阳性克隆序列测定结果显示，获得3个不同7肽序列。生物信息学分析结果显示所获得的3个肽序列均包含了一个抗原决定族(表位)；DNAstar软件对其亲水性、抗原指数和二级结构分析结果显示：它们的抗原指数均大于零，其中肽序列1和2(命名为ep1和ep2)抗原指数高达1.7，三段肽序列均呈现出不同程度的亲水性，而ep1和ep2在二级结构上还包含β—折叠和转角结构。本试验所筛选的序列经生物信息学分析，可能为抗原B细胞表位。
⑸采用搭桥PCR方法将上述所筛选的抗原表位序列进行连接，连接产物亚克隆到pGex—4T—1载体中，对重组质粒pGex—4T—ep进行诱导表达。结果表明：通过搭桥PCR方法成功地将三个表位连接到一起，重组质粒pGex—4T—ep经诱导后，SDS-PAGE和免疫印迹方法均证实了有明显的30kD大小目的条带出现，与预期结果一致。