背景急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）是重症患者发病和死亡的重要原因。ARDS是以肺水肿和急性炎症为特征的一种综合征。目前对于ARDS尚无特效的治疗方法,因此需要新的治疗手段。动物和细胞模型的应用为探索人类疾病的发病机制,疾病的诊断、治疗和预后,确定新的生物标志物以及药物研发发现新的靶点提供了重要的研究基础。脂多糖（lipopolvsaccharides,LPS）诱导的肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）屏障破裂导致其通透性增大是ARDS的重要发病机制。然而,LPS诱导PMVECs高通透性的分子机制尚未完全了解。埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白（Ezrin-Radixin-Moesin,ERM）家族的膜相关蛋白分布广泛,是连接丝状肌动蛋白和质膜的肌动蛋白结合分子。ERM蛋白可与细胞质信号分子结合,以整合膜运输与信号通路。本课题组既往研究证实ERM蛋白参与内皮细胞骨架重构所致的PMVECs通透性的改变。膜突蛋白（Moesin）作为ERM蛋白家族成员之一,其在内皮细胞中广泛表达,是膜蛋白与肌动蛋白骨架蛋白连接的桥梁,发挥细胞膜-细胞肌动蛋白骨架纽带作用。本课题组既往研究证实Moesin蛋白可作为苏氨酸底物而被磷酸化参与肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor,TNF-α）所致的PMVECs通透性的改变。因此在ARDS发病机制的研究中,特别是探讨ERM蛋白在ARDS中的作用,Moesin蛋白具有重要的意义,可选取Moesin蛋白作为契入点。N6-甲基腺苷（N6-Methyladenosine,m6A）甲基化修饰是发生在RNA分子腺苷上第六个氮原子的甲基化,对RNA剪接、翻译、稳定性以及m RNA和非编码RNA之间的表观遗传效应起着重要的调控作用,并参与多种细胞生物学过程。m6A甲基化修饰可以参与多种疾病的发生发展,在脓毒症诱导的心肌损伤和肾损伤中观察到其异常的表达。然而m6A甲基化修饰在LPS诱导ARDS发生发展中的作用尚缺乏研究数据。因此,本研究将通过细胞模型探讨ERM蛋白在LPS诱导的大鼠PMVECs（RPMVECs）高通透性中的作用机制,并使用LPS诱导的ARDS动物模型中深入探讨m6A甲基化在ARDS中的作用。目的探讨ERM蛋白是否参与了LPS诱导的RPMVECs高通透性以及可能的分子机制;同时,探讨m6A甲基化修饰是否影响LPS诱导的ARDS小鼠肺组织损伤。方法1.研究LPS对RPMVECs通透性的影响。将RPMVECs在Transwell小室上培养,分别采用浓度为0,0.1,1及10 mg/L的LPS刺激RPMVECs,并在0-2.5 h内,采用跨内皮细胞电阻（transendothelial electrical resistance,TER）法分别测量RPMVECs的通透性变化情况。2.研究LPS对RPMVECs中ERM蛋白苏氨酸磷酸化水平的影响。采用免疫印迹（western-blot）法检测不同浓度LPS（0,0.1,1及10 mg/L）刺激RPMVECs相同时间（30 min）以及相同浓度LPS（10 mg/L）刺激RPMVECs不同时间（0,5,15,30,60,90,120及180 min）时RPMVECs中ERM苏氨酸磷酸化蛋白水平表达的情况。3.研究LPS对RPMVECs中与ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1（ras-Related C3 Botulinum Toxin Substrate 1,Rac1）活性的影响。使用western-blot法检测10 mg/L的LPS刺激RPMVECs不同时间（0,15,30,60,90及120 min）时Rac1-GTP及Rac1-total蛋白水平的表达情况。为了明确Rac1在LPS诱导RPMVECs高通透性中的作用,进一步使用si RNA干扰Rac1基因表达,将特异性靶向Rac1基因的si RNA（si Rac1）转染至RPMVECs中,并采用western-blot法检测RPMVECs中的ERM蛋白苏氨酸磷酸化水平。4.研究O-Me-c AMP激活Rac1信号通路对LPS增加RPMVECs通透性的影响,采用10 mg/L的LPS诱导RPMVECs 2 h,并将200mmol/L的O-Me-c AMP和10 mg/L的LPS与RPMVECs共育2 h,采用TER法检测RPMVECs的通透性。接着将特异性靶向Moesin基因的si RNA（si Moesin）转染至RPMVECs中,在RPMVECs中构建Moesin基因敲低的细胞模型,并采用TER法检测RPMVECs的通透性以及western-blot法检测RPMVECs中Rac1-GTP及Rac1-total蛋白表达情况。5.采用LPS诱导构建ARDS小鼠模型,雄性C57BL/6品系小鼠,随机分为:NC组（正常组,不处理）、VC组（空载对照组,生理盐水造模）、LPS-3 h组（LPS处理3 h）、LPS-6 h组（LPS处理6 h）、LPS-12 h组（LPS处理12 h）、LPS-24h组（LPS处理24 h组）。各组小鼠体重称重和全肺称重,并取各组小鼠左肺下叶（LD）并使用多聚甲醛溶液固定,随后切片进行HE染色。采用Pannoramic 250数字切片扫描仪对切片进行图像采集,观察小鼠肺组织病理状态。6.为了明确m6A甲基化在LPS诱导的肺组织损伤中的变化,待处死动物后,取左肺上叶（LU）/右肺上叶（RU）/右肺下叶（RD）,提取组织RNA或蛋白,采用q RT-PCR法检测19个m6A相关因子（METTL3,METTL14,ALKBH5,FTO,WTAP,RBM15B,METTL16,e IF3a,hn RNP A2/B1,IGFBP1,IGFBP2,IGFBP3,KIAA1429,RBM15,YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1,YTHDC2）;采用western-blot检测7个m6A相关蛋白（METTL16,FTO,YTHDC1,IGFBP3,YTHDF1,YTHDF3,WTAP）在NC组、VC组、LPS-3 h组、LPS-6 h组、LPS-12h组、LPS-24 h组小鼠肺组织样本中的表达;并采用免疫组化检测5个m6A相关蛋白（FTO,METTL16,YTHDF1,YTHDF3,YTHDC1）在上述不同组别中的的免疫组化特征。7.为了进一步分析总体m6A和m5C修饰水平,采用TRNzol提取各组小鼠肺组织中的总RNA,利用液质联用色谱仪（UPLC-UV-MS）法检测各组小鼠肺组织中m6A和m5C的总体修饰水平变化情况。结果1.与对照组相比,LPS可影响RPMVECs通透性的改变,且随着LPS浓度增加和刺激时间的延长,RPMVECs通透性逐渐增加。2.10 mg/L的LPS诱导RPMVECs,0-30 min随着刺激时间增加,ERM苏氨酸磷酸化表达水平逐渐增加,30 min达峰,30-180 min随着刺激时间增加,ERM苏氨酸磷酸化表达水平逐渐降低;10 mg/L的LPS诱导RPMVECs,随着刺激时间增加,总ERM表达水平无明显增加。随着LPS浓度增加,ERM苏氨酸磷酸化表达水平逐渐增加,而总ERM表达水平亦无变化。3.10 mg/L的LPS诱导RPMVECs,随着刺激时间增加,Rac1-GTP表达水平逐渐降低,且与对照组相比,刺激120 min后Rac1活性下降了近76.5%,而Rac1-total表达水平无明显变化;与对照组相比,si Rac1组RPMVECs中的ERM磷酸化表达水平增加,而与对照组相比,si Rac1组RPMVECs中的ERM表达水平无明显变化;与LPS组相比,LPS+si Rac1组RPMVECs中的ERM磷酸化表达水平增加,而与LPS组相比,LPS+si Rac1组RPMVECs中的ERM表达水平无明显变化。4.与对照组相比,LPS组和LPS+O-Me-c AMP组RPMVECs通透性增加,O-Me-c AMP可恢复LPS刺激RPMVECs引起的TER下降。与si Control组和si Moesin组相比,LPS+si Control组、LPS+si Moesin组、LPS+si Moesin+si Rac1组通透性均增加,LPS+si Moesin+si Rac1组通透性增加幅度介于LPS+si Control组和LPS+si Moesin组之间。与si Control组相比,si Moesin组RPMVECs中的Rac1-GTP表达水平升高,而LPS+si Control组和LPS+si Moesin组RPMVECs中的Rac1-GTP表达水平降低,同时与LPS+si Control组相比,LPS+si Moesin组RPMVECs中的Rac1-GTP表达水平升高;而si Control组、si Moesin组、LPS+si Control组和LPS+si Moesin组RPMVECs中的Rac1-total表达水平相比无差异。5.动物实验结果显示,与对照组相比,LPS处理后各个时间点的小鼠肺重未见明显变化,但是小鼠体重在LPS处理12 h和24 h后有减少的趋势。6.采用HE染色观察小鼠病理状态,发现VC组:肺脏各级支气管结构较为正常,支气管纤毛上皮排列整齐,未见明显细胞脱落;肺泡上皮细胞较为正常,1例（1/2）肺泡腔内出血,见较多的红细胞溢出,2例（2/2）肺间质见极少量的炎性细胞浸润,以中性粒细胞为主;未见其它明显病理变化。LPS-6 h组:脏层胸膜结构较为正常,壁薄,无结缔组织增生、增厚;各级支气管结构完整清晰,上皮细胞形态正常,无明显变性坏死或脱落;Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞形态较为正常,未见明显变性、坏死,2例（2/2）间质见少量炎性细胞浸润,以杆状核中性粒细胞为主;未见其它明显病理改变。可见,与VC组肺脏组织相比,LPS-6 h组的肺脏病理损伤相对较重。NC组:肺脏组织各级支气管结构较为正常,支气管纤毛上皮排列整齐;肺泡上皮细胞形态基本正常,未见明显变性坏死,肺泡隔未见明显增厚,肺泡腔内见少量巨噬细胞,未见其它明显病理变化。LPS-3 h组:肺脏组织部分区域肺泡隔增厚,肺泡间质见较多分叶核的中性粒细胞浸润,血管腔内及血管周围间质内较多核圆形深染的淋巴细胞浸润,肺泡腔内可见胞质呈泡沫状的泡沫细胞浸润。LPS-12 h组在肺脏组织中观察到肺泡间质见较多淋巴细胞和中性粒细胞浸润,血管周围间质内较多淋巴细胞浸润,肺泡腔内可见巨噬细胞增多。综上所述,与NC组相比,LPS-3 h组和LPS-12 h组均可见不同程度病理改变,其中LPS-3 h组病变程度相对较重。7.采用q RT-PCR检测19个m6A相关因子在NC组、VC组、LPS-3 h组、LPS-6 h组、LPS-12 h组、LPS-24 h组中小鼠肺组织样本中的表达,结果显示:7个m6A甲基化转移酶METTL3,METTL14,WTAP,KIAA1429,METTL16,RBM15,RBM15B的表达在经过LPS处理后呈现下调趋势,KIAA1429和RBM15在LPS诱导后24 h表达显著下调,METTL16在LPS诱导后6 h下调趋势最显著。2个m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5的表达呈现下调趋势,其中FTO的表达下调显著,呈现时间依赖趋势,而ALKBH5在24 h时下调趋势显著。m6A识别因子e IF3a,YTHDF2,YTHDF3,YTHDC2,IGFBP2的表达呈现下调趋势。YTHDF1和YTHDC1在诱导6 h显著上调,其它因子的表达改变趋势不明显。8.western-blot结果显示7个m6A相关蛋白中METTL16和FTO蛋白的表达在LPS诱导的肺组织中呈现上升趋势,YTHDC1和IGFBP3呈现下调趋势,YTHDF1和YTHDF3在24 h时蛋白表达减少,WTAP未发生明显变化。9.免疫组化结果显示经LPS诱导后,小鼠肺组织中5个m6A相关蛋白的免疫组化特征发生显著变化,其中FTO蛋白的表达在LPS诱导的肺组织中呈现显著性上升趋势,METTL16在12 h和24 h时显著上调,YTHDF1和YTHDC1的表达则呈现下调的趋势。10.UPLC-UV-MS检测经LPS处理后小鼠肺组织中m6A和m5C的总体修饰水平变化情况,结果显示:各组间m5C总体表达稳定,LPS处理后随时间略有增长,但相对NC组略有下调;然而,各组间m6A总体修饰表达水平变化显著,在LPS诱导6 h后显著升高,随后呈现下调趋势。表明在LPS诱导6 h后,ARDS小鼠肺组织的m6A甲基化修饰增加。结论1.LPS诱导呈浓度和时间依赖性降低RPMVECs的TER,增加ERM苏氨酸磷酸化,同时使Rac1活性失活。Rac1和Moesin参与了LPS诱导的RPMVECs高通透性的介导,而Rac1和Moesin参与的RPMVECs高通透性的介导信号通路可以互相调节,磷酸化ERM通过负向调节Rac1活性介导LPS诱导RPMVECs的通透性增高。2.LPS诱导的ARDS小鼠肺组织发生明显的炎症病理特征,包括中性粒细胞,巨噬细胞浸润。同时,m6A甲基化修饰水平升高,METTL16,FTO,YTHDC1和YTHDF1在m RNA和蛋白水平上都发生不同程度的变化。LPS诱导的m6A甲基化在ARDS小鼠肺组织损伤中发挥重要的作用,可能成为ARDS诊断或治疗的潜在靶点。