论文部分内容阅读
据WHO资料统计，到2000年全球约有3.5亿HBV携带者。其中，大约有5％～10％的成人和80％～90％的儿童成为慢性乙型肝炎（CHB）。慢性乙型肝炎的长期病程结局是肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌（HCC）。目前，治疗慢性乙型肝炎最有效的药物是干扰素（IFN）和核苷类似物（如拉米夫定等）。对于肝脏有一定炎症活动的慢性乙型肝炎患者，规范应用IFN-α后HBeAg的转阴率或血清学转换率约有20％～40％。由于中国患者中许多系围生期或幼年时期感染，对HBV长期呈免疫耐受状态，IFN-α的抗HBV疗效大多不理想。拉米夫定为核苷类似物，具有强大的抑制HBV DNA复制的功效，但停药后常常导致HBV复制的“反跳”，且长期治疗易发生HBV聚合酶基因YMDD基序及其它位点的变异，导致拉米夫定耐药变异病毒株的出现和优势生长。以上表明慢性乙型肝炎的治疗仍然是困扰生物医学界的难题，亟需探求新型的治疗药物和方法。近年来一些研究者提出了许多特异性免疫治疗措施，其中选择应用IFN或各类免疫调节剂以打破慢性乙型肝炎病人T细胞免疫的无反应性的策略尤为引人注目，特别是采用重组蛋白疫苗和基因疫苗及肽疫苗的特异性疫苗治疗，已在动物模型中进行了研究并进入临床试验。 DNA疫苗能同时诱导体液和细胞免疫反应，因此在目前的研究中倍受重视。但其诱导免疫反应的效率相对较低，尤其是对于大的动物种系和 第四军医大学博士学位论文人类，这削弱了它们的实际应用。尽管花费了相当大的努力来提高DNA疫苗的运输和提呈效率，但在接种DNA疫苗后诱导的免疫反应中仍只能检测到少量的抗原。目前应用的提高和调节DNA疫苗诱导的免疫反应有两种补充策略，即:补充应用编码细胞因子的质粒;通过融合与细胞表面受体分子结合的抗原，将DNA疫苗编码的抗原靶向导入到细胞表面。 本研究中我们选择HBV preSZ+S基因片段作为 DNA疫苗的靶抗原，应用分子克隆技术构建了peDNA3.1525、peDNA3.1525/IFNa、pcDNA3.IIL一2/Fe、peDNA3SZS/Fe、peDNA3IFN一a五种真核表达质粒，并在Ver。一E6或SPZ/0真核细胞中进行了瞬时表达:重组质粒经大量制备纯化后免疫BALB/C小鼠，通过检测各组小鼠免疫后的抗一HBs滴度、CTL的杀伤活性、培养脾细胞的增殖分析、培养脾细胞细胞因子的分泌水平以及脾细胞中CD25的表达量，比较分析了含工L一2/Fc的质粒作为基因型佐剂对HBV preSZS DNA疫苗诱发免疫反应的影响;并且分析比较了peDNA3·1525/IFNQ和peDNA3SZS/Fe分别免疫后诱发的体液和细胞免疫反应。主要研究内容和结果如下:1.应用分子克隆技术，构建五种真核表达质粒pcDNA3.1525、 peDNA3.1525/IFN一a、peDNA3.IIL一2/Fe、peDNA3SZS/Fe、peDNA3IFN- a，经酶切和序列测定分析，确定目的片段的克隆和连接正确。2.通过脂质体介导，分别将它们转染入ver。一E6或SPZ/0细胞中，经 EL工SA和间接免疫荧光法证实，可以在真核细胞中正确表达目的蛋白。3.采用布比卡因预处理，100林g/只/次的方法肌肉注射后肢股四头肌分 组免疫BALB/c小鼠，分别检测诱导的体液和细胞免疫反应。4.pcDNA3.1工L一2/Fc免疫组在初次免疫后2周末即出现100%的抗一HBS 抗体阳转率，CTL杀伤活性、淋巴细胞的增殖反应、Thl型细胞因子 的分泌水平及脾细胞CD25的表达量都比对照组明显增强。5.为了确定抗原与佐剂的最佳应用方案，我们比较HBV DNA疫苗免疫后 第3天注射佐剂pcDNA3.l工L一2/Fc或两者同时注射诱导体液和细胞免 4 第四军医大学博士学位论文 疫效果，证明前者优于后者，后者诱导的免疫反应和HBV DNA疫苗单 独应用时效果相当。6.我们同时进行了HBV preSZS与工FN一a融合表达的重组质粒 pCDNA3.1525/工FN。的实验。通过检测体液和细胞免疫反应显示其诱 导的免疫反应比单独应用工FN一a质粒作为佐剂及对照组明显增强。7.pCDNA3SZS/Fc免疫组诱导的免疫反应与单独应用HBV DNA疫苗时的 效果相当。8.我们同时分析了抗原与细胞因子融合的形式pcDNA3.1525/工FN一Q质 粒和pCDNA3.1工L一2/Fc作为免疫佐剂组所诱导的免疫反应的结果，通 过SPSS统计软件分析，其差异没有统计学意义。