胃癌是临床最常见的消化道恶性肿瘤之一,全世界每年大约有100多万新发胃癌患者,在我国其发病率和病死率均为全身恶性肿瘤的首位,在国内某些地区已居全部恶性肿瘤死亡原因之首。近年来,随着胃癌相关研究的不断深入,人们在胃癌的发病机制和临床诊治方面取得了大量的成果,但目前,胃癌的诊治仍面临许多困难,整体治疗效果仍不理想,其临床特点依然表现为三低一高,即早期诊断率低(约10%),手术切除率低(<70%),5年生存率低(约40%),根治术后复发转移率高(约50%)。因此,积极寻找新的胃癌治疗手段,提高胃癌的治疗水平,具有积极而重要的现实意义。肿瘤基因治疗通常是指把正常的目的基因利用载体及基因转化方法导入患者体内,利用基因的功能抑制肿瘤细胞生长或杀死肿瘤细胞。自杀基因疗法又称为基因介导的酶前药治疗——GDE(Gene-directed enzyne prodrug treatment),已经成为手术治疗、放射治疗、化疗等传统肿瘤疗法后的一种新的抗肿瘤治疗措施。自杀基因(suicide gene)是指来自病毒和细菌等的一类可以将生物前药转换成有毒产物的基因。此类基因编码的特异性酶类,可以将对细胞本来没有毒或毒性极低的药物前体,在肿瘤细胞内代谢成毒性产物,杀死肿瘤细胞,导致这些细胞自杀。来源于大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶基因(E.coli cytosine deaminase, CD)及来源于病毒的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)是目前研究应用较多的两类自杀基因。大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因编码的酶为胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase),可激活5-氟胞嘧啶,变成5-氟尿嘧啶,从而抑制DNA和RNA的合成,发挥细胞毒作用。单纯疱疹病毒胸苷激酶基因编码胸苷激酶,可将核苷类似物代谢为二磷酸化物,进一步代谢为对细胞有毒性的三磷酸化合物,进而抑制DNA聚合酶发挥抗肿瘤作用。胃癌自杀基因治疗是指将自杀基因克隆至适当表达载体,然后导入胃癌细胞,自杀基因编码的特异性酶可以将无毒的药物前体代谢成毒性产物,达到杀死胃癌细胞的目的。在肿瘤基因治疗的研究中,基因的靶向性表达是亟需解决的关键问题之一。靶向性表达是指目的基因仅在肿瘤细胞表达,在正常细胞中不表达,从而减少对正常细胞的影响。有些基因的启动子能在肿瘤细胞中特异表达,而在正常细胞中不表达,利用这些启动子序列构建能在肿瘤细胞中特异表达的载体,让目的基因在肿瘤细胞中的特异表达,特异杀死肿瘤细胞,是目前肿瘤基因治疗靶向性的一个有效途径。目前在肿瘤研究中应用的启动子主要有：端粒酶基因启动子、癌胚抗原(CEA)启动子等,但这些启动子存在明显的缺点,如调控作用弱、应用范围窄、特异性不高等。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的一员,它在多数肿瘤中高表达,但是在成人正常终末分化组织中不表达或者是低表达,具有明显的肿瘤特异性。因此利用survivn特异启动子可以驱动下游目的基因在肿瘤细胞中的特异表达,从而避免对正常细胞的损伤。鉴于上述,在本实验中我们克隆了Survivin启动子,构建了Survivin启动子介导的CD/TK表达载体,转染至胃癌细胞,建立3ALB/C裸鼠胃癌模型,给予一定浓度的5-FC、GCV,证实了Survivin-CD/TK系统对裸鼠的胃癌皮下移植瘤有明显的靶向杀伤作用。本论文分为四部分：第一部分Survivin启动子的克隆及在胃癌细胞中的特异表达目的利用分子克隆技术,构建survivin介导的EGFP基因重组真核表达质粒,转染胃癌细胞,鉴定survivin启动子在胃癌细胞的特异表达。方法1.从人外周血白细胞中提取基因组DNA,设计合适引物,通过PCR扩增出survivin启动子并与pMD18-T载体连接,经筛选得到重组质粒pMD-survivin,进行酶切鉴定及测序。2.提取质粒pMD-survivin,酶切获得survivin启动子片段。采用同样酶切真核表达载体pEGFP-Cl,连接,转化细菌,构建重组真核表达载体pEGFP-Su,酶切鉴定。3.脂质体转化胃癌SGC7901细胞及正常胃上皮细胞株GES-1,72小时后荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。结果1.经酶切和测序证实成功获得survivin启动子(约910bp)。2.经酶切鉴定成功构建重组质粒pEGFP-Su。3.荧光显微镜下观察,survivin启动子介导的EGFP能特异在胃癌SGC7901细胞表达,而在正常的胃上皮GES-1细胞没有活性。第二部分重组pEGS-CD/TK双自杀基因载体的构建与鉴定目的利用分子克隆技术,构建pEGS-CD/TK双自杀基因载体。方法1.提取JE.coli BL21基因组DNA,设计合适引物,通过PCR扩增出CD基因并与pMD18-T载体连接,经筛选得到重组质粒pMD-CD,进行酶切鉴定及测序。2.提取pORF-HSVtk质粒,设计合适引物,通过PCR扩增出TK基因并与PMD18-T载体连接,经筛选得到重组质粒pMD-TK,进行酶切鉴定及测序。3.将质粒pMD-CD进行双酶切,获得CD基因片段,连接与相同酶切的真核表达载体pEGFP-Su上,构建重组真核表达载体pEGS-CD,酶切鉴定。4.再将质粒pMD-TK进行双酶切,获得TK基因片段,连接与相同酶切的真核表达载体pEGS-CD上,构建重组真核表达载体pEGS-CD/TK,酶切鉴定。结果1.经酶切和测序证实成功获得CD基因(约1281bp),TK基因(约1161bp)。2.经酶切鉴定成功构建重组质粒pEGS-CD。3.经酶切鉴定成功构建重组质粒pEGS-CD/TK。第三部分pEGS-CD/TK双自杀基因载体对胃癌SGC7901细胞的体外杀伤作用目的利用细胞转染技术,研究survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因系统对胃癌细胞SGC7901的体外杀伤作用。方法1.利用脂质体转染技术,将pEGS-CD/TK双自杀基因质粒转染胃癌SGC7901细胞、GES-1细胞。2. SGC790、GES-1细胞加入不同浓度的5-FC、GCV前体药物。MTT方法测定吸收值,计算细胞存活率。3.转染和未转染pEGS-CD/TK的SGC7901细胞混合,加入5-FC+GCV二者混合液,观察有无旁观者效应。4.应用RT-PCR检测转染细胞中CD、TK基因mRNA的表达；Western blot法检测转染细胞CD、TK蛋白的表达。5.流式细胞术检测细胞凋亡率。结果1.在给予5-FC、GCV后并达到一定浓度时,5-FC和GCV对SGC7901细胞存活率随着药物浓度的升高而呈现下降趋势,其体外杀伤作用具有浓度依赖性,且联合用药对SGC7901细胞体外的杀伤作用要强于二者单独应用；而不同浓度梯度的5-FC和GCV对GES-1细胞的细胞存活率改变不大。2.转染的SGC7901细胞即可引起大部分未转染的细胞发生凋亡,旁观者效应较为明显。3.通过RT-PCR和(?) Western blot检测证实CD,TK基因在SGC7901细胞中成功表达。4.转基因SGC7901细胞在给予前药处理24h后,治疗组SGC7901细胞凋亡率明显高于对照组凋亡率(P<0.01)。第四部分pEGS-CD/TK双自杀基因系统对胃癌SGC7901细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应目的观察survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因系统对胃癌SGC7901细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应。方法1.动物模型的建立：小鼠左腋下皮下接种2×106SGC7901细胞,第三天复种一次,建立胃癌动物模型。2. SGC7901皮下移植术后第10天,实验分为4组,每组10支。分组方法：A组：注射重组pEGS-CD/TK与前药5-FC与GCV；B组：仅注射重组pEGS-CD/TK;C组：仅注射前药5-FC与GCV；D组：空白对照,不施加任何处理。每3天测量一次皮下移植瘤的大小,计算瘤体体积。处死裸小鼠,HE染色,观察肿瘤的病理变化。3. RT-PCR检测(?)CD/TK基因的表达。结果1.接种肿瘤细胞后10天左右,出现皮下肿瘤结节。裸鼠成瘤达0.5cm后开始治疗。注射重组pEGS-CD/TK与前药5-FC与GCV组与仅注射pEGS-CD/TK,前药GCV和5-FC,空白对照组相比较,移植瘤体积明显缩小,有统计学意义(P<0.05)。2.治疗组切片中可见肿瘤细胞数目稀少,胞浆少,细胞核较小且染色较深,细胞分裂相少,核和胞浆凝缩及坏死区散在分布,纤维血管较少,可见炎性细胞浸润3.治疗组瘤体内RT-PCR可检测至(?)CD/TK基因表达结论1. Survivin启动子能在胃癌肿瘤细胞中特异表达。2.经酶切和测序鉴定,利用分子克隆技术成功获得CD和TK基因。3.成功构建重组Survivin启动子介导的CD/TK双自杀载体系统。4.含CD和TK融合基因的双自杀基因载体对SGC7901细胞具有强烈的杀伤作用,并且存在明显的旁观者效应。治疗组SGC7901细胞凋亡率明显高于对照组凋亡率(P<0.01)。5. RT-PCR及Western blot检测结果CD/TK基因在SGC7901细胞中成功表达。6.应用SGC7901细胞可成功建立致瘤BALB/C裸小鼠。7. Survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因能在胃癌小鼠的瘤体内特异表达。8. Survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因在前体药物GCV和5-FC作用下,能抑制胃癌瘤体的生长,具备体内抑瘤效应。