研究背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)重要并发症之一,是由微血管病变导致的、以持续蛋白尿及进行性肾功能损害为主要特征的肾脏疾病,也是导致终末期肾病(end-stage renal failure,ESRD)的常见病因之一,为患者及社会带来沉重的经济负担。糖尿病肾病是由多种复杂性因素共同作用导致的慢性疾病,糖脂代谢及血流动力学紊乱、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)的异常激活都参与了糖尿病肾病的发生发展。近年来越来越多的研究认为,糖尿病肾病是一种免疫炎症反应性疾病,低水平的慢性炎症在糖尿病肾病中的作用愈发重要。免疫细胞,尤其是单核/巨噬细胞激活在糖尿病肾病肾脏免疫炎症反应中发挥了关键性作用。单核/巨噬细胞是糖尿病肾病肾组织中数量最多的固有免疫细胞,高血糖、晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)募集单核细胞到肾脏微环境,激活单核/巨噬细胞中多条信号通路,促进多种细胞因子、趋化因子和粘附分子分泌,后两者又可以进一步活化其他肾脏免疫细胞(如T淋巴细胞等),介导肾脏固有细胞损伤。已有研究表明,敲除肾脏巨噬细胞可以显著减少糖尿病肾病患者尿蛋白,改善肾功能损伤。但是,考虑到巨噬细胞在糖尿病肾病损伤中的调控机制尚不明确,极大限制了其在临床中的应用。因此,寻找靶向调控肾脏巨噬细胞活化的关键分子,可以为糖尿病肾病的治疗提供重要的理论支持。T细胞免疫球蛋白和粘蛋白分子-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3,Tim-3)是最初被发现于Th1类细胞上的负性免疫调节分子,在多种炎症相关性疾病包括肿瘤、慢性感染性疾病中发挥重要作用。近期研究发现,Tim-3在各种固有免疫细胞,如NK细胞、NKT细胞、树突状细胞和巨噬细胞中都存在组成性表达且发挥着不同的调控作用。巨噬细胞作为一种广泛参与多种急、慢性炎症反应的重要固有免疫细胞,具有极强的异质性。相比于Tim-3在T细胞中的免疫负调控作用,Tim-3在巨噬细胞中的作用仍有争议。在不同疾病中,Tim-3可以调控巨噬细胞分别向M1型或M2型巨噬细胞分化,发挥促炎或抑炎的作用。目前,Tim-3在非肿瘤性肾脏疾病中鲜有研究。在一项缺血再灌注(ischemia reperfusion injury,IRI)诱导急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的研究中发现,Tim-3通过激活TLR4/NF-κB信号通路活化NLRC4炎症小体,加重肾脏缺血再灌注损伤。糖尿病肾病是临床中最常见的继发性慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD),也是糖尿病致死、致残的主要原因,Tim-3是否参与糖尿病肾病的发生发展,迄今仍未有报道。本课题拟通过深入研究Tim-3在糖尿病肾病中的表达、调控及其机制,阐明Tim-3可能是参与糖尿病肾病发生发展的重要分子,为糖尿病肾病免疫分子靶向治疗提供新的理论依据与实验数据。研究目的本课题是以糖尿病肾病为疾病模型,探讨Tim-3在糖尿病肾病发生发展中的作用及分子机制,为糖尿病肾病的免疫治疗提供新的参考依据。目的如下:1.明确Tim-3在糖尿病肾病中的表达情况。2.阐明Tim-3通过影响肾脏巨噬细胞功能调控足细胞损伤的作用。3.探讨Tim-3通过促进巨噬细胞活化,加重足细胞损伤,参与糖尿病肾病发生发展的作用机制。研究方法与结果第一部分Tim-3在糖尿病肾病中的表达1.Tim-3在糖尿病肾病小鼠肾组织中表达升高我们利用腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立Ⅰ型糖尿病肾病模型(STZ小鼠),瘦素受体缺乏的db/db小鼠作为Ⅱ型糖尿病肾病模型(db/db小鼠),野生型(wild type,WT)作为对照小鼠。利用蛋白质免疫印迹法(westernblot,WB)、实时定量荧光聚合酶链式反应(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)、免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)等实验方法检测小鼠肾组织中Tim-3的表达情况,结果显示无论在STZ小鼠还是在db/db小鼠肾组织中Tim-3的表达较对照组显著增加,且随着糖尿病肾病病程的延长,Tim-3的表达逐渐升高。IF双染检测糖尿病肾病小鼠肾组织中Tim-3和巨噬细胞表面标记CD68的定位情况,结果显示Tim-3主要表达于肾小球及肾小管质浸润的巨噬细胞中。流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测肾脏巨噬细胞中Tim-3的表达情况,结果显示Tim-3在糖尿病肾病小鼠肾组织巨噬细胞中的表达较对照小鼠显著上调。这些结果提示,Tim-3可能是通过调控肾脏巨噬细胞功能发挥作用的。2.Tim-3在糖尿病肾病患者中表达升高,且表达量与患者肾功能损伤呈正相关我们收集了部分糖尿病肾病患者及健康对照的外周血标本(n=18),利用FCM检测外周血单个核细胞CD14及Tim-3的表达,结果显示与健康对照相比,糖尿病肾病患者外周血单个核CD14+细胞比例明显升高,且其上Tim-3的表达也显著升高,提示Tim-3在调控糖尿病患者免疫功能紊乱中发挥关键性作用。此外,我们利用IHC检测糖尿病肾病患者肾活检标本中Tim-3的表达情况(肾肿瘤患者瘤旁健康组织作为对照),结果表明Tim-3在糖尿病肾病肾组织中的表达较对照组显著升高。利用Spearman correlation进行Tim-3表达量与糖尿病肾病患者肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、尿白蛋白肌酐比值(urinary albumin to creatinine ratio,UACR)之间的相关性分析,结果表明Tim-3的表达量与患者eGFR呈负相关(R2= 0.6247,P=0.0065)、与UACR呈正相关(R2 = 0.3437,P = 0.0276)。3.体外高糖、糖基化终末产物诱导巨噬细胞Tim-3表达升高无菌提取小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PIM)和骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM),利用高糖培养基(high glucose,HG)或AGE分别刺激小鼠巨噬细胞,正常糖(normal glucose,NG)、高渗甘露醇(mannitol,MAN)及牛血清白蛋白(bull serum albumin,BSA)作为对照。WB及RT-PCR检测巨噬细胞中Tim-3的表达,结果显示HG或AGE诱导巨噬细胞中Tim-3表达增加,且随着刺激物浓度的增加表达逐渐上调。上述结果初步阐明,Tim-3在糖尿病肾病肾组织及体外高糖诱导活化的巨噬细胞中表达明显升高,临床标本研究验证Tim-3的表达量与患者肾功能受损情况呈显著正相关,提示Tim-3可能通过调控肾脏巨噬细胞功能参与糖尿病肾病过程。第二部分Tim-3调控糖尿病肾病巨噬细胞活化的作用和机制研究1.慢病毒敲减肾组织Tim-3表达,显著改善糖尿病肾病足细胞损伤我们利用shRNA为载体的Tim-3干扰慢病毒(Tim-3 shRNA-lv)肾脏局部注射干扰肾组织Tim-3表达,ctrl-lv作为阴性对照病毒,并在此基础上构建糖尿病肾病模型。利用WB、IHC检测糖尿病肾病小鼠肾小球足细胞标记蛋白Nephrin、WT-1的表达情况,结果显示Tim-3 shRNA-lv组Nephrin、WT-1表达较ctrl-lv组显著增加。利用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察小鼠肾脏超微结构变化,结果表明Tim-3 shRNA-lv组肾小球足细胞足突融合、脱落显著减轻。这些结果提示干扰Tim-3对STZ诱导的糖尿病肾病小鼠足细胞损伤发挥保护性作用。2.敲除Tim-3显著减少糖尿病肾病小鼠蛋白尿水平,改善足细胞损伤为了避免慢病毒干扰的不稳定性,排除脱靶效应,我们又利用Tim-3全身敲除小鼠(Tim-3 knockout,Tim-3 KO)作为实验对象,WT小鼠作为对照,STZ腹腔注射构建糖尿病肾病小鼠模型。Elisa检测各组小鼠UACR,结果显示Tim-3全身敲除显著降低糖尿病肾病小鼠尿蛋白水平。WB、IHC检测Nephrin和WT-1的表达,结果表明敲除Tim-3显著改善小鼠足细胞损伤。Tunel染色结果证实敲除Tim-3可以减少高糖引起的肾实质细胞凋亡,保护肾功能。3.Tim-3+巨噬细胞促进足细胞骨架蛋白重排,介导足细胞凋亡、脱落由于缺乏髓系特异性敲除Tim-3的小鼠作为研究工具,为了克服体内实验的局限性,我们进一步设计了体外巨噬细胞条件性培养基(conditioned medium,CM)刺激足细胞及巨噬细胞、足细胞共培养的相关实验,以求阐明Tim-3调控巨噬细胞参与足细胞损伤的作用及机制。首先,我们利用不同浓度HG、AGE刺激不同来源巨噬细胞(PM、BMDM),收集巨噬细胞上清体外刺激小鼠足细胞系(mouse podocyte cell,MPC),WB、PCR检测MPC中Nephrin、Podocin及CD2AP的表达,结果表明HG、AGE刺激的巨噬细胞条件性培养基可以诱导足细胞凋亡、坏死及功能障碍。然后,我们利用不同浓度HG、AGE刺激Tim-3KO或WT小鼠PM,收集上清刺激MPC细胞,重复上述检测,结果表明Tim-3KO巨噬细胞上清刺激的MPC中Nephrin、Podocin、CD2AP表达较高,表现出显著的足细胞保护作用。此外,足细胞划痕试验(starch assay)及足细胞transwell试验通过测量足细胞迁移距离和足细胞穿过PET膜的数量检测足细胞的迁移能力,配合LSC观察检测F-actin表达,评估足细胞结构蛋白损伤情况,从而预测糖尿病肾病病情的严重程度。结果显示,HG刺激的Tim-3+巨噬细胞上清促进足细胞骨架重排,足细胞迁移功能下降,而敲除巨噬细胞中Tim-3可以显著改善足细胞微丝蛋白的结构,重塑足细胞形态学功能。4.过继回输Tim-3+巨噬细胞加重糖尿病肾病小鼠蛋白尿及足细胞损伤为了明确Tim-3是否通过调控巨噬细胞功能在糖尿病肾病中发挥作用,我们设计了尾静脉过继回输巨噬细胞(bone macropahges transfer,BMT)的相关实验。Elisa检测小鼠UACR结果显示,过继回输Tim-3+巨噬细胞可以显著增加糖尿病肾病小鼠尿蛋白排泄。肾脏PAS染色结果显示,过继回输Tim-3+巨噬细胞组小鼠肾脏组织学损伤更严重,表现为较多的肾小球系膜基质沉积,基底膜增厚。WB、IHC检测肾组织Nephrin表达,结果显示过继回输Tim-3+巨噬细胞,肾小球足细胞足突融合、丢失更为明显。Tunel染色检测小鼠肾组织细胞凋亡情况,结果显示过继回输Tim-3+巨噬细胞,肾脏固有细胞凋亡较对照组明显增多,以上结果提示Tim-3确实是通过调控巨噬细胞激活加重糖尿病肾病足细胞损伤的。5.Tim-3激活巨噬细胞NF-κB/TNF-α信号通路,参与糖尿病肾病进展5.1体内敲减澈除肾脏Tim-3抑制糖尿病肾病小鼠NF-κB/TNF-α信号通路作为广泛存在的重要转录分子,糖尿病肾脏中,肾实质细胞及各种免疫细胞均可观察到转录因子NF-κB的激活,我们利用WB、IHC检测发现p-p65 NF-κB在肾小球及肾小管间质浸润的巨噬细胞中的表达较正常对照组显著升高,而在Tim-3KD/KO小鼠中p-p65 NF-κB的表达显著下调。作为NF-κB的下游,炎症因子IL-1,IL-6,TNF-α等的分泌与糖尿病肾病免疫炎症反应密切相关。RT-PCR、Elisa检测肾组织中部分促炎细胞因子的表达的表达(如TNF-α、IL-6),结果显示敲减、敲除Tim-3后,糖尿病肾组织中TNF-α表达明显降低,而其他细胞因子(如IL-6等)的变化无显著统计学差异,提示TNF-α可能是Tim-3调控NF-κB下游信号通路的关键分子。5.2体外干扰巨噬细胞中Tim-3抑制高糖诱导的NF-κB信号通路激活,减少TNF-α分泌高糖诱导肾脏浸润巨噬细胞活化,激活NF-κB信号通路,释放TNF-α、IL-6等细胞因子,直接或间接作用于肾小球足细胞。HG刺激Tim-3KO或WT小鼠腹腔巨噬细胞24h,WB、Elisa、PCR等实验技术检测p-p65 NF-κB、p65 NF-κB及各种细胞因子表达,结果显示Tim-3基因沉默可以抑制巨噬细胞中NF-κB蛋白磷酸化,减少TNF-α的分泌,而IL-6的水平无显著性差异。5.3 Tim-3活化巨噬细胞,部分依赖于NF-κB/TNF-α信号通路为了验证NF-κB/TNF-α是否是Tim-3调控糖尿病肾病巨噬细胞活化的必要信号通路,我们设计了部分体外联合阻断实验。我们利用NF-κB抑制剂(BAY11-7082)预处理巨噬细胞lh,随后转染Tim-3-siRNA,收集高糖培养的细胞上清刺激MPC,IF检测肌动蛋白微丝F-actin表达,激光共聚焦(laser scanning confocal,LSC)观察足细胞肌动蛋白纤维骨架的情况,结果表明BAY明显抑制NF-κB的磷酸化,消除了巨噬细胞Tim-3敲除所带来的足细胞保护作用,WB检测足细胞标记蛋白Nephrin的表达水平也证实了这一现象。此外,我们利用TNF-α敲除小鼠作为研究对象(WT小鼠作为对照),体外分离小鼠腹腔巨噬细胞,给予两组巨噬细胞转染Tim-3-siRNA,WB、LSC等检测结果表明,阻断TNF-α也可以明显抵消巨噬细胞Tim-3敲除对足细胞的保护作用。这些结果共同提示,Tim-3通过活化巨噬细胞加重高糖诱导的足细胞损伤,至少部分依赖NF-κB/TNF-α信号通路起作用。研究结论根据以上实验结果,我们初步明确了Tim-3在糖尿病肾病中的表达及其参与糖尿病肾病发生发展的分子机制,并得出以下结论:1.Tim-3在糖尿病肾病肾组织中表达升高,尤其在肾脏浸润巨噬细胞中升高明显,其水平与糖尿病肾病患者肾脏损伤程度呈显著正相关。2.体内敲减、敲除肾脏Tim-3可以显著减少STZ诱导的糖尿病肾病小鼠尿蛋白水平,改善足细胞损伤,过继回输Tim-3+巨噬细胞促进糖尿病肾小球基质增生、基底膜增厚,加重肾脏损伤。3.体内外实验证实,Tim-3通过激活NF-κB/TNF-α信号通路,加剧糖尿病肾病足细胞损伤及蛋白尿,参与糖尿病肾病的发生发展。创新性及研究意义本课题首次发现Tim-3在糖尿病肾病动物模型及患者中表达上调,敲减、敲除肾脏Tim-3可以显著缓解糖尿病肾病足细胞损伤及蛋白尿。高糖通过诱导肾脏巨噬细胞Tim-3表达,激活巨噬细胞中NF-κB/TNF-α信号通路,加重糖尿病肾病足细胞损伤和蛋白尿生成,加剧糖尿病肾病的病情进展。这为糖尿病肾病的免疫治疗提供新的思路,为寻找糖尿病肾病新的治疗靶点提供理论依据。