第一部分外源性Ngb保护低氧缺血海马神经元损伤的在体观察一.低氧小鼠模型的建立目的：研究低氧处理对小鼠海马神经元的损伤,及外源性Ngb对低氧所致小鼠海马神经元损伤的保护作用。方法：使用小鼠专用低氧箱,给予小鼠8%氧气6h。同时设置常氧组小鼠作为对照。Ngb不同干预组小鼠于低氧复氧即刻起腹腔分别注射重组人源Ngb(B,17KD)及其改构体(A,20.3KD；E,18KD)5mg/kg.d,连续3天,常氧及低氧对照组分别给予相同体积的生理盐水。常氧下复氧72h后采用NeuN免疫染色检测不同干预组小鼠海马神经元丢失情况。结果：免疫组化染色结果显示,小鼠在8%氧气6h,然后常氧下复氧72h后,低氧对照组小鼠海马CA1和CA2区神经元丢失明显,重组Ngb及其改构体组海马CA1和CA2区神经元丢失均较低氧对照组明显减少有统计学意义。结论：小鼠低氧6h复氧72h将严重损伤海马神经元,外源性给予Ngb可以有效减少海马神经元丢失。二.缺血小鼠模型的建立目的：研究缺血处理对小鼠海马神经元的损伤,及外源性Ngb对缺血所致海马损伤的保护作用。方法：双侧颈总动脉结扎15分钟制备全脑缺血模型。假手术组小鼠经历相同的过程但不夹闭颈总动脉,作为对照组。Ngb不同干预组小鼠于缺血再灌注即刻开始分别腹腔注射外源性Ngb及其改构体5mg/kg.d,连续3天,假手术组和手术对照组分别给予相同体积的生理盐水。脑血流再灌注72h后采用NeuN染色检测不同干预组小鼠海马神经元丢失情况。结果：小鼠缺血再灌注72h后,手术对照组海马CA1和CA2区神经元较假手术组明显丢失,但给予Ngb干预后海马CA1和CA2区神经元丢失较手术对照组明显减少。结论：缺血再灌注可以使海马神经元丢失,但外源性给予Ngb干预后可以有效减少海马神经元的丢失。三.外源性Ngb对低氧缺血小鼠神经营养因子的影响目的：探索Ngb对低氧或脑缺血小鼠脑内神经营养因子的影响以及对星形胶质细胞的作用。方法：用半定量RT-PCR分析各组小鼠脑匀浆中G-CSF、BDNF、GDNF、CNTF等神经营养因子mRNA的表达情况,之后用ELISA法测定G-CSF蛋白水平。同时采用GFAP染色检测海马DG区星形胶质细胞的激活情况。结果：低氧复氧及脑缺血再灌注可以促进多种神经营养因子mRNA表达,Ngb干预后G-CSF、BDNF、GDNF、CNTF mRNA表达进一步增加；在蛋白水平层面,脑组织中G-CSF的量在Ngb组较对照组明显增多；同时发现Ngb组海马DG区GFAP染色阳性细胞数较对照组也有明显增多。结论：Ngb可以增加低氧或脑缺血后G-CSF、BDNF、GDNF、CNTF mRNA和G-CSF蛋白水平的表达,同时可以激活DG区的星形胶质细胞。第二部分外源性Ngb对缺血缺氧损伤保护作用的离体研究一.外源性Ngb对神经元的作用目的：观察体外培养的神经元在正常培养条件下,Ngb促细胞增殖和刺激G-CSF分泌的作用；以及在OGD模型上观察Ngb的抗凋亡和促进G-CSF分泌的作用。方法：在正常培养条件下,采用MTT法测定不同Ngb在不同浓度下干预神经元24h、48h和72h后的细胞增殖率,同时用ELISA法测定细胞上清液中G-CSF的含量；在OGD模型上,采用LDH和MTT法测定OGD 3h后复氧Oh、3h、6h、12h、24h各组细胞死亡和生存情况,以ELISA法测定同一时间点上细胞上清液中G-CSF的水平。结果：正常培养条件下,神经元在Ngb干预24h、48h、72h后细胞增殖率均较同一时间点的对照组有所增加,而且在干预48h达到高峰,在这一时间点上细胞上清液中的G-CSF含量也较对照组增加,其中Ngb高浓度组G-CSF含量增加最为明显；在OGD模型上,LDH测定验证OGD 3h后复氧12h、24h后Ngb干预组死亡率较对照组明显下降,同时MTT法也证实OGD 3h复氧12h、24h后Ngb干预组细胞生存率较对照组明显升高,其中在复氧24h效果更佳。OGD 3h复氧24h后,Ngb不同浓度的干预组上清中G-CSF含量均比对照组高,而Ngb高浓度组G-CSF含量增加最为明显。结论：Ngb可以促进神经元的增殖,同时可减轻OGD所致细胞损伤,提高神经元生存率,在OGD及正常培养条件下,Ngb可以促使神经元分泌G-CSF增加。二.外源性Ngb对星形胶质细胞的作用目的：观察体外培养的星形胶质细胞在正常培养条件下,Ngb刺激G-CSF分泌的作用；以及在OGD模型上观察Ngb的抗凋亡和促进G-CSF分泌的作用。方法：在正常培养条件下,采用ELISA法测定不同结构Ngb在不同浓度下干预星形胶质细胞24h、48h和72h后细胞上清液中G-CSF的含量；在OGD模型上,以MTT测定OGD3h复氧0h、3h、6h、12h、24h各组细胞生存情况,以ELISA法测定同一时间点上细胞上清液中G-CSF的水平。结果：正常培养条件下,给予Ngb干预可以促使细胞分泌的G-CSF水平上升,其中Ngb-B、A高浓度组在干预48h后的分泌量达到最高峰,改构体E却为高浓度组干预72h的分泌量最大；在OGD模型上,MTT法证实OGD 3h复氧12h、24h后Ngb干预组细胞生存率比对照组明显增加,在复氧24h效果更佳。OGD 3h复氧24h后,Ngb不同浓度的干预组上清中G-CSF含量均比对照组高,而且高浓度组G-CSF含量增加最为明显。结论：Ngb可减轻OGD所致细胞损伤,提高星形胶质细胞的生存率,在OGD及正常培养条件下,Ngb均可以刺激星形胶质细胞分泌G-CSF增加。三.外源性Ngb神经保护作用机制初探目的：在体外培养的神经元和星形胶质细胞OGD模型上初步探讨Ngb作用机理。方法：收集OGD 3h后复氧24h不同Ngb干预的星形胶质细胞培养上清液中G-CSF含量最高的上清液作为条件培养液(ACM-Ngb),同时设置PBS组作为对照培养上清液(ACM-PBS),在神经元OGD 3h复氧即刻加入,复氧24h后MTT测定细胞生存率,LDH测定细胞死亡率；为确认G-CSF在Ngb介导的神经保护中的权重,加入G-CSF受体抗体阻断神经元G-CSF/G-CSF受体信号通路,设置同型IgG抗体作为对照组。神经元再经历OGD损伤3h在复氧即刻加入ACM-Ngb和高浓度的Ngb,复氧24h后MTT测定细胞生存率,LDH测定细胞死亡率。结果：ACM-Ngb可以提高OGD损伤后神经元的生存率,减少细胞死亡率,和ACM-PBS对照组比较有统计学差异；ACM-Ngb或高浓度的Ngb作用于G-CSF受体阻断后的神经元,其经历OGD3h复氧24h损伤后生存率较对照组下降,死亡率增加。结论：体外OGD模型证实,Ngb可以通过星形胶质细胞旁分泌的G-CSF和神经元自分泌的G-CSF起到神经保护作用。结论1.8%低氧6h复氧72h或双侧颈总动脉结扎15分钟再灌注72h将严重损伤小鼠海马神经元,Ngb可减少低氧或缺血所致海马神经元的丢失。2.Ngb在体可增加低氧复氧或缺血再灌注后G-CSF、BDNF、GDNF和CNTF mRNA的表达和G-CSF蛋白的分泌,同时具有激活星形胶质细胞的作用。3.Ngb离体可以促进常态培养下神经元的增殖,具有减轻OGD所致神经元及星形胶质细胞的损伤,提高细胞生存率。4.在OGD及正常培养条件下,Ngb可以促使神经元及星形胶质细胞分泌G-CSF增加,G-CSF受体阻断实验确认Ngb可以通过内源性G-CSF起神经保护作用。