论文部分内容阅读
弓首蛔虫病主要是由弓首科（Toxocaridae）弓首属（Toxocara）的犬弓首蛔虫（Toxocara canis,T.canis）寄生于人体及多种动物引起的一种严重的人兽共患病。人和动物感染犬弓首蛔虫通常是食源性感染,即意外摄入T.canis的感染性虫卵或者未煮熟的肉/内脏中的感染性幼虫而感染。T.canis的感染性幼虫只在终末宿主的小肠内发育为成虫,在人或其他非特异宿主体内不能发育为成虫,而是移行到其他组织和器官,造成弓首蛔虫病。该病的临床类型可分为眼睛幼虫移行症（Ocular larve migrans,OLM）、内脏幼虫移行症（Visceral larva migrans,VLM）、隐性弓首蛔虫病（Covert toxocariasis,CT）和神经弓首蛔虫病（Neurological toxocariasis,NT）等。黏蛋白（mucins,MUC）是一类由黏多糖组成的高分子量糖蛋白,主要存在于上皮组织中,具有PTS结构域,即含有丰富的丝氨酸（serine,P）、苏氨酸（threonine,T）和脯氨酸（proline,S）残基,这些残基都是高度氧糖基化,N端和C端富含天冬酰胺和半胱氨酸。MUC在细胞黏附、分化、免疫应答、肿瘤形成、以及细胞信号传导的过程中具有多样化的生物学功能。MUC主要分为膜结合黏蛋白和分泌型黏蛋白。膜结合黏蛋白的羧基末端具有一个跨膜结构域,能将自身连接到质膜（Plasma membrane）（如MUC-1,MUC-3,MUC-4,MUC-16,MUC-17）,促进细胞-细胞/蛋白质-蛋白质结合,以及信号转导和蛋白质稳定;分泌型黏蛋白（如MUC-2,MUC-5AC,MUC-5B）能被包装成分泌物进入囊泡参与胞内信号转导。在哺乳动物组织中,黏蛋白为上皮表面提供黏性和物理保护,并携带大量对细胞运输和黏附作用的聚糖。黏蛋白1（MUC-1）是黏蛋白家族中的重要成员,起着识别细胞、保护细胞以及维持黏性等作用。犬弓首蛔虫黏蛋白1（Tc-MUC-1）是犬弓首蛔虫幼虫在转续宿主体内产生的排泄/分泌蛋白（Excretory-secretory proteins,ESP）,主要参与机体免疫,对宿主免疫逃避发挥重要作用。目前国内外对Tc-MUC-1研究较少。本研究克隆了T.canis黏蛋白1基因（Tc-muc-1）,利用His pull-down和质谱筛选犬弓首蛔虫黏蛋白1（Tc-MUC-1）与小鼠巨噬细胞相互作用的蛋白,并利用免疫共沉淀技术验证互作蛋白,主要试验结果总结如下:1.Tc-muc-1基因的克隆及序列分析本研究以T.canis幼虫总RNA为模板,克隆了Tc-muc-1基因的完整编码区（coding sequence,CDS）序列并进行序列分析。结果发现该基因编码区序列为531bp,共编码176个氨基酸。功能结构域分析发现Tc-MUC-1包含1个由11个STSSSSA重复序列构成的Mucin结构域和2个36个氨基酸组成的Sh KT结构域;GO分析显示具有蛋白质结合和金属离子结合功能;多重序列比对发现Tc-MUC-1与T.canis的其余4个黏蛋白（Tc-MUC-2–Tc-MUC-5）均含有2个Sh KT结构域;种系发育进化树分析显示Tc-MUC-1与双胃线虫（Pristionchus pacificus）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）进化关系较近,与类圆线虫（Strongyloides ratti）和犬钩虫（Ancylostoma caninum）的进化关系较远。2.Tc-MUC-1原核表达载体的构建及表达本研究克隆了Tc-muc-1基因完整编码区序列,构建了Tc-muc-1/p Cold TF原核表达载体,测序结果显示插入p Cold TF载体中的序列长度为546 bp。将重组质粒转化到Transetta（DE3）大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞,阳性菌在IPTG诱导下以可溶性形式表达重组蛋白,蛋白大小为75 k Da。对诱导表达条件进行优化,最优表达条件为15℃下,菌液OD600为1.0时加入0.6 m M IPTG诱导24 h可获得目的蛋白大量表达;通过镍离子亲和层析介质（Ni-NTA）对重组蛋白进行纯化,结果显示以250 m M浓度的咪唑洗脱时效果较好,得到的重组蛋白浓度高。3.Tc-MUC-1与小鼠巨噬细胞互作蛋白的筛选采用His pull-down技术,将诱导表达的重组蛋白Tc-MUC-1作为Pull-down的诱饵蛋白,在体外钓取与Tc-MUC-1发生相互作用的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）总蛋白,并经质谱鉴定,获得了219个候选Tc-MUC-1互作蛋白。将鉴定得到的互作蛋白进行GO功能注释分析发现Tc-MUC-1的互作蛋白主要存在胞外体、囊泡、胞外区等细胞组分,可以参与核糖体、吞噬体、内质网蛋白质加工、有机氮化合物合成和代谢、细胞酰胺代谢等生物学过程;进行KEGG功能注释分析发现Tc-MUC-1的互作蛋白有潜在发挥RNA结合、杂环化合物结合、有机环状化合物结合等分子功能;互作蛋白网络构建显示,Tc-MUC-1介导的互作蛋白主要参与细胞内碳代谢、氨基酸生物合成、内质网蛋白质加工等生物学过程。4.Tc-MUC-1与小鼠巨噬细胞互作蛋白的验证采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）技术验证蛋白质相互作用,根据质谱鉴定和生物信息学分析,选取了6个候选Tc-MUC-1互作蛋白作为研究对象:即过氧化物酶1（PRDX1）、纤维蛋白1（PFN1）、肌动蛋白结合蛋白1（CFL1）、醛糖还原酶（AKR1B3）、表皮型脂肪酸结合蛋白5（FABP5）和Rho-GDP解离抑制因子（ARHGDIA）。首先克隆了Tc-muc-1以及小鼠Prdx1、pfn1、Cfl1、Akr1b3、Fabp5、Arhgdia基因的CDS,然后构建了Tc-muc-1/p CDNA3.1-Flag真核表达载体,同时也构建了pfn1/p CMV-HA、Akr1b3/p CMV-HA、Cfl1/p CMV-HA、Prdx1/p CMV-HA、Fabp5/p CMV-HA、Arhgdia/p CMV-HA真核表达载体;最后在HEK293T细胞中共转染Tc-muc-1/p CDNA3.1-Flag和pfn1/p CMV-HA、Akr1b3/p CMV-HA、Cfl1/p CMV-HA、Prdx1/p CMV-HA、Fabp5/p CMV-HA、Arhgdia/p CMV-HA,分别收集共转染后过表达的蛋白并进行Co-IP验证。结果显示Tc-MUC-1能与CFL1和FABP5发生结合,不与PRDX1、PFN1、AKR1B3、ARHGDIA结合。说明Tc-MUC-1能与小鼠巨噬细胞中的CFL1、FABP5蛋白发生相互作用,推测Tc-MUC-1在T.canis感染宿主后诱导宿主免疫应答起着重要作用。