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研究背景:结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)是引起结核病发病的病原菌。已有研究表明[1],机体感染M.tb后,M.tb可隐藏于宿主巨噬细胞内,通过抑制巨噬细胞抗M.tb自噬,逃逸免疫杀伤,造成潜伏感染。现已有多种研究证明,清除胞内菌感染主要依靠于固有免疫和诱导保护性细胞免疫。一般认为巨噬细胞和淋巴细胞在抗结核感染免疫中起重要作用。本实验室前期从细胞水平研究发现:LPS能通过上调TLR4的表达水平,以及ROS产量上升从而促进巨噬细胞对M.tb的氧依赖性的杀伤,IFN-γ可以促进巨噬细胞对病原体的自噬。因此本研究从动物模型水平进一步研究非M.tb来源的TLR4受体激动剂LPS对小鼠单核-巨噬细胞抗结核杆菌免疫功能的调控作用。目的:研究LPS对感染结核杆菌小鼠单核-巨噬细胞抗结核杆菌免疫功能的调控作用。方法:1.取M.tb(H37Ra)在苏通氏液体培养基中,培养箱培养1个月后转种于7H11固体培养基中,37°C恒温培养箱内培养1个月,使用无菌接种环收取M.tb菌种于1 ml匀浆器中,加入Tween-80反复研磨,取细菌悬液,用Tween-80经10000 rpm×2 min洗涤3次,抗酸染色阳性且镜下观察细菌分散。使用分光光度仪检测菌液浓度,并用生理盐水稀释成浓度为2×108CFU/mL的M.tb悬液,放入4°C冰箱备用。2.调整M.tb减毒株H37Ra活菌量的浓度为(2×108CFU/ml)尾静脉打入C57BL/6小鼠体内,分别于7天、14天、21天处死小鼠,取肺、脾组织做病理切片和研磨培养,同时称取肺脾重量,检测脏器重量指数,确定M.tb是否成功感染小鼠。3.根据LPS试剂说明LPS致小鼠发热剂量为500ng/kg,故将LPS剂量设为250ng/kg、500ng/kg、750ng/kg,尾静脉打入C57BL/6小鼠体内,10h后脱颈处死做病理切片,以明确LPS在小鼠体内的安全使用剂量。4.分组给药7天、14天、21天后摘眼球取血后外周抗凝血,流式细胞术检测lps对各组外周血中单核细胞表面tlr4表达水平、胞内ros产量的促进作用。5.分组给药7天、14天、21天后取小鼠外周抗凝血,进行细胞内染色,流式细胞仪检测表达ifn-γ和il-4t细胞亚群比例。6.分别于用药后7天、14天、21天无菌分离小鼠肺、脾脏,石蜡切片后行he染色,镜下观察m.tb感染的小鼠肺、脾组织损伤情况。7.分别于用药后7天、14天、21天无菌分离小鼠肺、脾脏,置于平皿内200目不锈钢筛网上研磨,pbs-吐温80稀释研磨,并稀释接种于7h11培养皿上,37℃恒温培养21d,镜下观察是否有结核菌生长。结果:1.不同浓度lps尾静脉注射给药后,病理结果显示lps在小鼠体内不引起明显炎症和组织损伤的最大安全剂量为250ng/kg。2.脏器重量指数、病理结果以及组织培养结果显示结核杆菌减毒株h37ra2×108cfu/ml,尾静脉注射14天后,可成功感染小鼠。减毒结核分枝杆菌h37ra经尾静脉注射感染小鼠模型可造成部分结核病样病理性损伤。3.感染m.tb的小鼠,在lps给药7天开始,外周血单核细胞中tlr4的表达水平(80.00±37.97)%,明显高于未给药组(15.66±10.14)%,差异有统计学意义(p<0.01)。说明lps可增强小鼠体内被m.tb抑制的单核-巨噬细胞表面tlr4受体的表达率。4.感染m.tb的小鼠,在lps给药14天后外周血单核细胞中ros产量(104.76±18.65)明显高于未给药组(55.70±3.43)(p<0.01)。说明lps可增强小鼠体内被m.tb抑制的单核细胞表面ros的产量,其中7天表达量最大后逐渐下降。5.感染m.tb小鼠,在lps给药14天后外周血中表达ifn-γ的t细胞比例(11.52±1.43)%明显高于未给药组(3.84±1.11)%(p<0.01);给药7天后,外周血中表达il-4的t细胞比例(2.67±0.14)%即开始显著低于未给药组(4.78±1.14)%(P<0.01),下降明显增大。6.组织培养和病理结果皆可以证明LPS对M.tb感染的小鼠肺、脾组织损伤的逆转作用。结论:1.低浓度LPS可在不引起炎症损伤条件下,上调结核杆菌感染小鼠抗结核免疫功能。2.低浓度LPS可有效减轻M.tb感染小鼠的组织损伤。