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衰老是所有生物体均需经历的多因子参与的复杂的生物学过程,伴随着一系列衰老相关的疾病,如神经退行性疾病、心血管疾病、内分泌系统疾病、骨骼系统疾病和癌症等的发生。衰老的进程受到进化上较为保守的信号通路所调控,这为延缓衰老和预防衰老相关疾病提供了可能。一些重要且保守的长寿信号通路,如胰岛素信号通路、TOR、AMPK、Sirt均需要或部分需要通过重要的转录因子FoxO发挥其作用。FoxO是一个进化上保守的寿命调节基因,在酵母、线虫、果蝇与小鼠中上调FoxO的表达量都能够延长寿命。家蚕BmFoxO基因也能调控家蚕寿命。由于BmFoxO编码的蛋白属于转录因子,故而需要通过调控下游靶基因来实现生物学作用。因此,鉴定BmFoxO的靶基因,寻找下游影响衰老的基因就变得尤为重要。本研究主要基于表达谱测序鉴定BmFoxO的靶基因。主要获得了如下研究结果:(1)BmFoxO靶基因的筛选将构建成功的BmFoxO过表达和干涉载体转染家蚕卵巢细胞系,提取RNA进行表达谱测序。BmFoxO过表达组与对照组比较,筛选得到差异表达基因4144个,其中上调基因3624个、下调基因520个。BmFoxO干涉组与对照组比较,筛选得到差异表达基因4563个,其中上调基因4240个、下调基因323个。利用维恩图将两组基因集取交集后共筛选得到受BmFoxO正向或负向调控的靶基因212个。其中受BmFoxO正向调控的基因90个,负向调控的基因122个。这些差异表达基因共参与了54个信号通路,涉及代谢、蛋白稳态、信号转导、衰老及衰老相关疾病等。根据BmFoxO特异性识别的保守的结合基序(TTGTTTAC),对上述的212个基因的上游3K序列进行筛查,得到43个潜在的BmFoxO直接靶基因。FoxO靶基因在线虫、果蝇和哺乳动物中是相对保守的。从网站NCBI GEO编号GSE44686获得果蝇FoxO(dFoxO)的靶基因数据,与BmFoxO过表达组数据进行同源对比分析,得到两个物种共有的靶基因565个。这些靶基因参与了100个信号通路,涉及代谢、蛋白稳态、信号转导、运输与分解、衰老等。将上述所筛选到的43个BmFoxO潜在的直接靶基因,与dFoxO靶基因进行比对分析,其中有4个基因是BmFoxO与dFoxO共有的靶基因,39个是BmFoxO特有的靶基因。结合功能注释,我们筛选出2个BmFoxO与dFoxO共有的可能影响衰老和衰老相关疾病的靶基因BGIBMGA002618、BGIBMGA000459;3个BmFoxO特有的可能影响衰老和衰老相关疾病的靶基因BGIBMGA012030、BGIBMGA009731、BGIBMGA005655。将这5个基因作为家蚕BmFoxO候选靶基因进行验证。(2)BmFoxO靶基因的验证首先,经荧光定量验证了BmFoxO能够正向或负向调控BGIBMGA002618、BGIBMGA000459、BGIBMGA012030、BGIBMGA009731、BGIBMGA005655的表达水平,过表达BmFoxO后,BGIBMGA012030的表达水平上调最为显著,约为对照组的20倍。其次,截取靶基因上游含有TTGTTTAC基序的调控序列,进行双荧光素酶实验。结果表明,BmFoxO能够与靶基因上游调控序列结合,显著激活荧光素酶活性。BmFoxO对BGIBMGA005655的上游序列的调控活性最高,约为对照组的30倍,进一步对其上游调控序列进行截短实验,通过双荧光素酶实验,得到BmFoxO调控BGIBMGA005655上游核心序列位于上游0.8K。(3)BGIBMGA005655序列分析及功能探索利用生物信息学对BGIBMGA005655蛋白结构进行分析,发现其为亮氨酸富集重复序列蛋白,具有5个亮氨酸拉链(LRR);系统发生分析表明,BGIBMGA005655在各物种中广泛分布。家蚕幼虫5龄3天幼虫组织表达分析显示,BGIBMGA005655在家蚕头、表皮、中肠和后部丝腺高量表达。成功构建了BGIBMGA005655细胞过表达载体pIZ/V5-Red-5655和干涉载体pIZ/V5-Red-SiRNA5655。免疫荧光实验表明,BGIBMGA005655表达的蛋白质主要位于细胞质中。在细胞中改变BGIBMGA005655表达水平,未发现影响细胞周期与细胞增殖活力,其具体的生物学功能还需要深入地研究。综上所述,本研究筛选得到212个受BmFoxO正向或负向调控的靶基因,其中有43个为潜在的受BmFoxO直接调控的靶基因。已确定基因BGIBMGA002618、BGIBMGA000459、BGIBMGA012030、BGIBMGA009731、BGIBMGA005655是受BmFoxO调控的靶基因。初步发现,BGIBMGA005655不会对细胞周期与细胞增殖造成影响,其具体的生物学功能还有待探索。