胆汁淤积是临床常见的综合征,是指胆汁的合成、排泄过程发生障碍,导致胆汁成分在肝细胞中堆积,进一步导致血液中胆汁成分的含量升高。肝脏是胆汁酸、胆红素等合成、分泌、排泄及其再循环的重要器官。胆汁酸代谢要维持平衡,主要依赖于胆汁酸的摄取和排泄实现相对平衡;为了完成这种生理需要,肝细胞内产生了一套精细的胆汁酸摄取和排泄系统,由一系列分布于基底膜或小管侧膜上的功能不同的转运蛋白构成,如有机阴离子转运多肽(organic anion transporter polypeptides,OATPs),胆盐输出泵(bile salt export pump,BSEP),钠离子-牛磺胆汁酸共转运蛋白(sodium/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP),多耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated proteins,MRPs)等。这些转运蛋白分布于肝细胞膜的不同部位,它们互相协调,分工合作,对胆汁的形成、维持胆汁酸正常代谢、平衡,实现其生理功能并抵御胆汁酸毒性损伤起到重要的生理作用。目前认为,胆汁酸转运蛋白的异常改变可能是胆汁淤积发生、发展的重要分子机制。多耐药相关蛋白2(MRP2)是具有ATP结合域的盒式跨膜转运子蛋白超家族(ATP binding cassette transporter proteins superfamily)中C亚族成员,它主要位于肝细胞膜表面,此外在肾脏、大肠、小肠等器官组织中也有表达。在肝脏,MRP2主要位于肝细胞的顶膜侧,亦即小管侧,它是胆汁转运、代谢中的一个重要蛋白,主要生理作用是向细胞外转运有机阴离子复合物,其重要转运底物为结合胆红素,其次还有二价的硫酸盐、谷胱甘肽、其它葡萄糖醛酸结合物以及多种药物。MRP2的功能障碍可导致血液内胆红素的堆积,在人体可表现为Dubin-Johnson综合征。因此MRP2是维持胆汁酸代谢平衡中非常重要的一个跨膜转运蛋白。正常生理状态下,肝组织的MRP2处于高表达状态,以维持正常胆汁酸代谢的需要。而且已知的直接调控MRP2转录水平的核受体对其均为正向调控,及促进MRP2的转录及表达。但许多人体和动物研究中均发现,当发生胆汁淤积时,MRP2的表达是明显降低的,而其分子机制尚不明确。胆汁淤积时伴有许多炎症介质和细胞因子水平的升高,如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)6等,许多研究也提示这些炎症因子不仅是继发于胆汁淤积的炎症反应,同时也对肝细胞膜表面的各种胆汁酸转运体具有调控作用。有研究发现胆道梗阻时il-18表达水平增高,解除梗阻后il-18水平可回复;另有研究发现在坏死性肠炎动物模型中il-18和肝脏mrp2可能存在负相关。这些研究结果提示il-18可能对mrp2的表达有调节作用,但尚无研究证实并阐述机制。本研究拟从hepg2细胞及大鼠两个水平探讨il-18在调节mrp2表达中的作用及分子机制。主要的研究方法与结果1.hepg2细胞中il-18通过nf-κb/fxr/yy1通路下调mrp2的表达。以il-18刺激人肝癌细胞株hepg2,以实时定量聚合酶链式反应(real-timequantitativepolymerasechainreaction,real-timeqpcr)和westernblot的方法检测hepg2细胞mrp2、核因子kappab(nuclearfactorkappab,nf-κb)、法尼酯x受体(farnesoidxreceptor,fxr)、转录因子阴阳1(yinyang1,yy1)表达量的变化;再以nf-κbp65亚基的短发夹rna(shorthairpinrna,shrna)及yy1shrna转染hepg2细胞,观察p65及yy1基因干扰对il-18诱导的mrp2、fxr、yy1表达变化的影响。1.1以il-18刺激体外培养的hepg2细胞,用real-timeqpcr及蛋白质印记(westernblot)方法检测mrp2的mrna表达水平和蛋白质表达水平,确定il-18对mrp2的具有下调作用,且呈剂量与时间依赖关系。1.2确定在hepg2细胞中il-18可以下调mrp2表达后,再以westernblot方法检测筛选il-18刺激后存在显著差异性表达并可调控mrp2转录的核因子,筛选后发现fxr在il-18刺激后有显著的降低;进一步以不同浓度的il-18刺激hepg2细胞后发现,fxr表达的降低与il-18呈剂量依赖关系,提示il-18可抑制fxr的转录和表达。而fxr已被明确证实可促进mrp2的转录,fxr的抑制可能导致了mrp2的抑制。但因为调控mrp2表达的核受体不仅仅有fxr,为确定mrp2的降低与fxr有直接关系,我们进一步检测了fxr的另一个下游基因cyp7a1,发现它随着fxr的下降而升高,由此我们确定mrp2的降低确系与fxr的降低有关。1.3在筛选il-18刺激hepg2细胞后差异性表达的核因子、转录因子过程中还发yy1表达明显增高,且与il-18呈剂量依赖关系。进一步以yy1(shorthairpinrna,shrna)转染hepg2细胞,抑制yy1表达,再以il-18刺激hepg2细胞,发现原本接受il-18刺激后下调的fxr和mrp2表达均有明显回升,提示转录因子yy1参与了il-18下调fxr及mrp2的过程。这与文献报道的yy1可直接结合于fxr转录子启动区并抑制fxr的转录相符。1.4以il-18刺激hepg2细胞后发现核蛋白水平的p65升高、磷酸化p65蛋白升高,提示nf-κb通路的激活。进一步以p65shrna干扰nf-κb通路后发现,原本接受il-18刺激后升高的yy1表达出现回落,提示yy1的表达升高是通过nf-κb通路的激活来调控的。细胞水平的研究结果提示,il-18可通过nf-κb信号通路的激活而上调转录因子yy1的表达;而因为yyi具有抑制fxr转录的调控作用,因此随着yy1表达水平的升高,fxr的表达水平出现降低,并直接导致了受其调控的mrp2表达的降低。为了验证这些结果,我们进一步进行了动物实验。2.在胆道结扎的spraguedawley(sd)大鼠肝组织中观察到mrp2、nf-κb、fxr、yy1、il-18等的变化趋势符合体外细胞实验的结果。我们将10只sd大鼠随机分为2组,即胆道结扎组和假手术组,每组5只。bdl组大鼠接受胆总管结扎手术,假手术组大鼠在胆总管下方铺设手术线,但不结扎胆管。术后7天收集肝脏标本提取总rna和蛋白,以实时定量pcr和westernblot的方法检测大鼠肝组织il-18、mrp2、nf-κb、fxr、yy1的表达量变化。2.1相对于假手术组,bdl组大鼠肝组织中il-18mrna水平显著升高,证实了胆汁淤积时肝组织内il-18的表达是明显升高的,首先验证本研究的基础问题,并与其它有关胆汁淤积时il-18血清水平升高的报道相符。2.2相对于假手术组,bdl大鼠肝组织中nf-κbp65的mrna水平明显增加,细胞核中的p65蛋白表达量明显增多,p65的磷酸化水平也明显升高,验证了胆汁淤积时肝组织内nf-κb通路激活水平是增高的。2.3相对于假手术组,bdl大鼠肝组织中yy1的mrna及蛋白水平明显升高,而fxr和mrp2的mrna及蛋白水平则明显降低,符合体外细胞实验的结果;2.4在大鼠肝组织中以染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)的方法检测fxr与mrp2基因启动子区的结合情况,发现在bdl大鼠肝组织中与mrp2启动子区结合的fxr显著降低,进一步证实了胆汁淤积时fxr表达的减少与mrp2的表达降低直接相关。讨论多耐药相关蛋白2(mrp2)是胆汁酸代谢平衡中的关键分子。生理状态下mrp2分子呈现高表达状态,以维持胆汁酸的正常排泄,但是在胆汁淤积时其表达量却明显降低,机制尚不清楚。许多研究已证实,在发生胆汁淤积时,许多细胞因子都表现出对胆汁酸转运蛋白的重要调节作用。il-18在胆汁淤积时也会出升高,但其是否也参与了胆汁酸转运蛋白的调控尚未可知。近期有研究显示,在小鼠坏死性肠炎模型中发现,il-18与肝脏mrp2之间存在负相关性。我们假设胆汁淤积时,il-18的升高可能不仅仅炎症反应(机体的一种防御性反应)的一部分,它也可能对胆汁淤积的发生发展有影响,而这种影响极有可能是通过调节mrp2的表达来实现的。我们先在hepg2细胞水平上进行了研究。首先我们证实了il-18对mrp2确有调节作用。以il-18刺激hepg2细胞后,mrp2的mrna表达和蛋白水平表达均出现不同程度降低,且分析发现其降低与il-18之间呈现剂量与时间依赖效应。随后我们研究了il-18是通过何种机制实现了下调mrp2这一作用。鉴于已知的核受体对mrp2的调节均为正向,我们推测il-18抑制mrp2表达可能是通过抑制了某个核受体的表达而间接实现的。于是我们检测了这些核受体在il-18刺激后的蛋白表达情况,发现fxr表达从转录水平到蛋白水平均出现了显著的下调。在胆汁酸代谢中,fxr是促进mrp2转录表达的重要核受体。fxr的降低极有可能导致了mrp2表达的降低。我们还发现,fxr表达的下调与il-18之间也存在剂量依赖关系,与mrp2表达下调趋势一致。而为了更进一步证明mrp2的下调确与fxr相关,我们还检测了fxr调控下游的另外一个基因cyp7a1的表达。fxr具有间接抑制cyp7a1表达的作用。我们的检测发现il-18抑制fxr表达的同时,cyp7a1的表达出现明显升高,其另一个下游基因mrp2表达明显降低,fxr两个下游基因均出现符合fxr变化趋势的变化规律,更进一步证实il-18诱导的mrp2表达下调可能直接由fxr的下调所导致。但是fxr的抑制又似乎不是il-18刺激的直接结果。近期一项研究发现yy1可以结合到fxr基因内含子的一个特殊反应原件上,从而抑制fxr基因的转录。于是我们推测是否胆汁淤积时fxr表达的降低也与yy1有关。我们检测了il-18刺激后hepg2细胞中yy1的表达水平,发现yy1的mrna和蛋白表达水平均呈明显升高趋势,且与il-18存在剂量依赖关系。为进一步验证yy1表达升高是否导致了fxr表达的降低,我们对hepg2细胞进行了yy1shrna干扰。我们发现yy1干扰后的hepg2细胞,再接受il-18刺激后,其fxr和mrp2的表达水平仅仅出现轻度的下降,其下降的幅度明显小于普通hepg2细胞接受il-18刺激后的fxr及mrp2表达下降的幅度。也就是说,yy1基因干扰削弱或部分阻断了il-18抑制fxr和mrp2表达的效应。换言之,yy1参与了il-18抑制fxr和mrp2表达的调控机制。最后我们还进一步阐明了il-18促进yy1表达的机制。我们通过检测nf-κbp65亚基在细胞核内的含量及其磷酸化水平,证实il-18可激活hepg2细胞的nf-κb信号通路。进一步以p65shrna阻断了nf-κb信号通路后发现,il-18诱导的yy1表达升高也随着nf-κb的抑制而被抑制,同时原本接受il-18刺激后被抑制的fxr和mrp2表达水平却出现回升。简言之,il-18刺激的yy1表达是通过nf-κb信号通路传导的。在细胞实验完成后,我们勾勒出了il-18抑制mrp2表达的大致信号通路,即il-18通过nf-κb信号通路激活yy1的表达,上调的yy1抑制了fxr的转录,从而间接的导致了mrp2的转录及表达。为了进一步证实以上结论,我们还建立了胆道结扎(bileduct-ligated,bdl)的大鼠模型,从大鼠肝脏组织中验证胆汁淤积时上述因子的变化趋势是否与细胞水平中观察到的各因子变化趋势一致。首先我们检测了假手术组和bdl组大鼠肝组织中il-18mrna的表达水平,结果提示bdl大鼠肝组织中il-18mrna水平是明显增高的,证实了整个研究的基础。这也与文献报道胆汁淤积时血清il-18水平升高相一致。然后我们发现bdl大鼠肝组织中p65的基因转录水平是增高的,肝组织核蛋白水平的p65含量是增多了,而磷酸化p65的表达量也增多,证实了胆汁淤积时nf-κb通路是激活的。其次,我们检测到bdl大鼠肝组织中yy1的表达上调,而fxr与mrp2的表达明显下调,均与细胞水平中il-18刺激后以上各因子的表达变化趋势一致。相关性分析则进一步显示了各因子之间均存在良好的相关性。我们知道除fxr外,mrp2还受到其它核受体的调控。为了进一步证实胆汁淤积时mrp2的下调与fxr的关系,我们在大鼠肝组织中进行了染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)实验。chip结果显示,bdl大鼠肝组织中与mrp2启动子区域相结合的fxr数量明显少于假手术组,证实了胆汁淤积中由于fxr自身转录水平的下降,使得其与mrp2启动子区的结合也是降低的,从而削弱了其促进mrp2转录的调控能力,导致mrp2表达的下降。动物实验进一步验证了细胞实验中各因子的变化情况,证实了胆汁淤积时肝组织内il-18水平的上调和nf-κb信号通路的激活,证实了yy1表达的上调和fxr、mrp2表达的下调,并证实了fxr的下调是导致mrp2下调的主要原因之一。结论本研究在hepg2细胞中发现il-18通过抑制fxr的表达而诱导mrp2的表达降低;同时发现il-18通过激活的nf-κb通路上调了转录因子yy1的表达,而上调的yy1与fxr抑制明显相关。在进一步的动物实验中证实了胆汁淤积时il-18的升高、nf-κb通路的激活、yy1表达的增高以及fxr和mrp2表达的降低,并且证实fxr表达的降低直接导致了mrp2的表达下降。综上所述,本研究揭示了胆汁淤积时mrp2下调的一种可能机制,即增高的il-18水平通过激活nf-κb通路而上调转录因子yy1的表达,上调的yy1抑制了fxr的转录和表达,从而导致了mrp2的表达下调。该调控机制的发现,对于阐明胆汁淤积发生、进展机制有重要的理论意义,并可能为临床寻找胆汁淤积治疗策略提供新的思路。