肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC，以下简称肝癌）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率在恶性肿瘤内居第五位，死亡率居第三位。全球每年有60-70万人死于肝癌，约55％发生在中国。尽管在过去的几十年中，在HCC中获得了很多进展，包括早期发现、手术切除、肝移植和分子靶向治疗等，但肝癌患者的预后仍然令人失望，术后高转移复发率已成为提高HCC远期疗效的瓶颈。近年来研究者逐渐重视从肿瘤微环境(Tumor Microenvironment)角度出发，探索各种免疫治疗手段，试图改变肿瘤免疫反应状态，从而探索治疗肿瘤的有效干预手段。大量证据显示，HCC是一个典型的炎症相关性癌症，主要受肝炎病毒感染和肝硬化所致，大量炎症、免疫细胞和相关分子是肿瘤微环境的重要组成之一。HCC术后复发转移和不良预后可能受局部的免疫状态所决定或影响。就此而言，这些炎症、免疫细胞和它们所表达的一些关键介质，可能为HCC免疫治疗提供潜在的靶点。　　淋巴细胞是肿瘤免疫微环境的重要组成部分，许多细胞亚群在肿瘤免疫中的作用得到了深入研究与认识:细胞毒性T细胞（CD8+T细胞）、NK细胞(NatureKill cells，NK cells)和NKT细胞(Nature kill T cells，NKT cells)发挥抑癌免疫效应，辅助性T细胞向不同方向分化，如Yh1、Th2、Th17和调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)也可发挥不同的免疫效应。分析淋巴细胞在肝细胞癌与癌旁组织中的基因差异性表达，可能为进一步深入研究与复发转移和预后相关的基因提供线索，从而为肿瘤的免疫治疗提供新的思路和证据。　　在本项研究中，我们首先建立并完善了从肝癌及癌旁组织中分离浸润淋巴细胞的技术，并用流式细胞术检测癌与癌旁浸润淋巴细胞中主要抗肿瘤效应细胞的不同类型及比例，为后续实验提供基础。之后，收集了15例HCC癌与癌旁组织的淋巴细胞样本，进行全基因表达谱芯片的检测，并对结果进行分析;主要通过对不同部位（癌与癌旁）、不同的临床病理特征（肿瘤大小、有无镜下癌栓）的比较，运用差异基因、通路(Pathway)和基因本体(Gene Ontology, GO)分析比较基因的差异性表达。接着，我们用103例配对HCC癌与癌旁组织中浸润淋巴细胞样本，利用实时荧光定量PCR(Real Time PCR, RT-PCR)技术，对全基因表达谱芯片筛选出的有代表性的40个差异基因进行验证，并分析与临床病理特征之间的关系。最后，我们用324例HCC的组织芯片，采用双重免疫组织化学的方法，检测肝癌和癌旁组织中代表活化状态的CD39+Foxp3+ Treg的数量、比例的差异及与预后之间的关系，同时进一步研究了CD39表达情况与预后的关系。　　第一部分肝癌和癌旁组织中浸润淋巴细胞的分离和鉴定　　本研究旨在探索肝细胞癌患者外周血及肿瘤局部（肝癌病灶、癌旁肝组织）浸润淋巴细胞分离方法，并检测主要的抗肿瘤效应细胞的类型及比例。　　通过不连续密度梯度离心法分离11例配对肝癌患者外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear cells，PBMCs）、肝癌浸润淋巴细胞(TumorInfiltrating Lymphocytes，TILs，TL)及癌旁浸润淋巴细胞（Peritumor InfiltratingLymphocytes，PILs，PL），运用流式细胞技术检测不同部位抗肿瘤效应细胞的类型及比例差异。　　结果发现肝癌及癌旁淋巴细胞纯度和活力良好（纯度＞95％，活力＞90％）。流式细胞术检测发现癌旁CD3阳性T细胞的比例高于外周血，提示肝组织中成熟T淋巴细胞比例增高。进一步比较CD4阳性T细胞，发现在外周血中CD3+CD4+CD8-T细胞比例最高（52.47±15.94％），外周血及癌内比例高于癌旁(P＜0.001，P=0.001)。癌内CD3+CD4-CD8+T细胞在外周血、癌及癌旁比例依次上升（37.45±14.79 vs41.39±13.63 vs56.17±12.21％）。癌旁与外周血、癌旁与癌内比例有差异显著(P=0.003，P=0.003)，癌内CD8+T淋巴细胞较癌旁降低，并有CD4/CD8比例倒置(1.585/0.499)。CD3-CD56+ NK细胞癌内比癌旁明显减少（12.66±7.62 vs22.77±13.51％，P=0.026）;CD3+CD56+ NKT细胞在外周血、癌及癌旁比例依次上升（3.35±2.22 vs6.81±5.07 vs16.05±8.52％），癌内与癌旁、外周血与癌旁比较差异有统计学意义(P＜0.001，P=0.006)，癌内NK及NKT细胞比例较癌旁低。而CD3+Vα24+ NKT细胞表达外周血比例＜1％，明显低于癌内及癌旁(P=0.045，P=0.041)，癌与癌旁相比无明显差异。　　本实验表明分离的肝癌与癌旁浸润淋巴细胞纯度活力良好，分离方法可行，可用于后续实验研究。肝癌局部浸润淋巴细胞与癌旁相比，存在着CD4/CD8比例倒置、CD8阳性T细胞、NK和NKT细胞的比例下降，提示癌内存在着主要抗肿瘤效应细胞的比例下降。　　第二部分全基因表达谱芯片检测淋巴细胞在肝癌与癌旁组织中的基因差异性表达　　本研究旨在用全基因表达谱芯片检测淋巴细胞在肝细胞癌与癌旁组织中的基因差异性表达。　　通过收集15例配对肝癌和癌旁浸润淋巴细胞(TL和PL)标本后，进行mRNA抽提及质检合格后，采用全基因表达谱芯片技术检测其基因表达，数据标准化后进行t检验，筛选出倍数改变(Fold Change)≥2的基因为表达显著上调基因，Fold Change≤0.5为表达显著下调基因（所有差异性基因均满足P＜0.05）。通过差异基因分析得出Pathway和GO分析结果。　　结果发现15例肝细胞癌中，肿瘤直径大于5cm者9例(TL1，PL1)，小于等于5cm者6例(TL2，PL2);镜下癌栓者8例(TL3，PL3)，无癌栓者7例(TL4，PL4)。全基因组表达谱芯片共检测出19，786个基因的表达水平。TL-PL比较有521个基因上调，456个基因下调。TL-PL比较中有“补体与凝血级联系统通路”上调，有“NK细胞介导的细胞毒通路”、“抗原加工与递呈通路”下调，GO改变主要集中在固有免疫及杀伤功能的受损。TL1-PL1比较857个基因上调，827个基因下调，TL1-TL2比较1501个基因上调，1282个基因下调，差异基因数目在各组别中最多，提示肝癌随着肿瘤增大，癌与癌旁浸润淋巴细胞差异的基因表达数目增加，肿瘤大小对癌内浸润淋巴细胞的差异基因表达影响较大;而TL3-TL4比较仅15个基因上调，3个基因下调，PL3-PL4比较7个基因上调，7个基因下调。肿瘤较小时，癌与癌旁差异基因集中在“NK细胞介导的细胞毒通路”的下调。随着肿瘤增大，激活促炎症细胞因子基因的“Toll样受体通路”、“Jak-STAT信号通路”下调。另外PL1与PL2相比，出现了Th2抗炎细胞因子的上调(IL4，IL-8)。　　本实验表明肝癌与癌旁浸润淋巴细胞存在着基因差异性表达，主要表现在“补体与凝血级联系统通路”上调及“NK细胞介导的细胞毒通路”、“抗原加工与递呈通路”的下调，并有固有免疫及杀伤功能的受损。肿瘤大小对癌与癌旁浸润淋巴细胞的差异基因表达影响较大。肿瘤较小时，肿瘤内出现免疫效应细胞的功能下降，随着肿瘤进展，激活促炎症细胞因子的通路下调伴随癌旁Th2抗炎细胞因子的上调。　　第三部分肝癌和癌旁组织中的浸润淋巴细胞差异性表达基因的验证　　本研究旨在对全基因表达谱芯片筛选出的淋巴细胞在肝癌与癌旁组织中的差异性表达基因进行RT-PCR验证。　　收集2012年5月～2013年9月期间肝细胞癌手术标本103例，进行癌与癌旁浸润淋巴细胞的分离;运用实时荧光定量PCR技术检测全基因表达谱芯片筛选出的癌与癌旁浸润淋巴细胞具有代表性的40个差异性表达基因，并结合患者的临床病理资料进行分析，进一步验证基因芯片的可靠性和可重复性。　　结果发现所验证的基因中36个（≥90％）显示出与全基因表达谱芯片一致的上调和下调趋势，这些编码重要分子的基因涉及效应细胞的杀伤功能(FASL和PRF1)及NK细胞毒通路(CD244和NKG2D等)、浸润淋巴细胞的转录活化分子(EOMES，TBX21和TXK等)、共信号分子及受体（TNFRSF11A和CTLA4）、细胞因子、趋化因子及受体和整合素（IL8，XCL1和ITGAV等）及细胞表面抗原和其他免疫相关分子（CD160和BCOR等）。其中大部分基因表达与肿瘤大小、数目、分化、包膜、血管侵犯、分期、AFP分级、GGT分级其中一个或以上临床病理资料明显相关。　　本研究表明淋巴细胞在肝癌与癌旁组织中的存在着多种免疫相关基因的差异性表达，这些差异表达基因主要集中在效应细胞的杀伤功能、转录活化分子、共信号分子及受体、细胞因子、趋化因子及受体和整合素等。全基因表达谱芯片结果具有可靠性和可重复性。　　第四部分肝癌和癌旁组织中的CD39+Foxp3+调节性T细胞的差异表达及与预后关系研究　　探讨CD39+Foxp3+调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg细胞)在肝细胞癌及癌旁的差异表达及与预后关系，并探讨CD39在肝癌的表达情况与预后关系。　　通过双重免疫组织化学染色，分析CD39+Foxp3+ Treg在324例肝细胞癌患者癌及癌旁组织中的数目及CD39+Foxp3+/ Foxp3+比例差异，进一步分析癌内CD39+Foxp3+数目与肝癌患者预后关系;通过免疫组织化学染色，蛋白免疫印迹方法，研究CD39在肿瘤不同细胞上的表达，并探讨其表达情况与预后的关系。　　结果发现Foxp3+Treg和CD39+Foxp3+ Treg在癌内数目明显高于癌旁(14.17vs4.99，P=0.001;11.53 vs3.39; P＜0.001)， CD39+Foxp3+/Foxp3+Treg的比例在癌内高于癌旁(83.34 vs79.19％，P=0.013)。单因素分析肝癌内浸润Foxp3+和CD39+Foxp3+Treg高浸润组至复发时间(Time to recurrence，TTR)和总体生存率(Overall Survival, OS)均低于低浸润组（TTR，P=0.030和P=0.029; OS，P=0.024和P=0.014）。而癌旁Foxp3+Treg高浸润组术后复发时间低于低浸润组(TTR，P=0.024)。多因素分析显示癌Foxp3+和CD39+Foxp3+ Treg是肝癌患者OS的独立预测指标(P=0.035和P=0.019)。癌旁Foxp3+Treg亦可作为术后复发的独立预测指标(P=0.021)。进一步研究发现CD39在肝癌内表达广泛，血管内皮细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞及上都有表达，癌内CD39表达明显高于癌旁(0.0552 vs0.0387，P＜0.001)。单因素预后分析发现，肝癌内CD39高表达组TTR和OS均低于低浸润组(P=0.009和P=0.005)，多因素分析显示肝癌内CD39表达是预后的独立因素（TTR,P=0.033; OS，P=0.021）。而癌旁CD39高表达与术后高复发率相关（单因素P=0.001;多因素P=0.003）。　　本研究表明肝癌中CD39+Foxp3+ Treg数目及CD39+Foxp3+/Foxp3+ Treg比例较癌旁明显增高，浸润数目与肝癌总体生存率相关。肝癌局部存在着CD39的高表达、广泛表达并与术后复发及总生存率相关。　　结论　　1肝癌浸润淋巴细胞与癌旁组织中淋巴细胞相比，存在着CD4/CD8倒置、CD8阳性T细胞、NK和NKT细胞的比例下降，提示肝癌内主要抗肿瘤效应细胞的比例下降。　　2淋巴细胞在肝癌和癌旁组织中存在着基因的差异性表达，主要表现在“补体与凝血级联系统通路”上调及“NK细胞介导的细胞毒通路”、“抗原加工与递呈通路”的下调，并有固有免疫及杀伤功能的受损。肿瘤大小对癌与癌旁浸润淋巴细胞的差异基因表达影响较大。　　3肝癌与癌旁组织中浸润的淋巴细胞存在着多种免疫相关基因差异表达，这些差异表达基因主要集中在效应细胞的杀伤功能、转录活化分子、共信号分子及受体、细胞因子、趋化因子及受体和整合素等。全基因表达谱芯片结果具有可靠性和可重复性。　　4肝癌中CD39+Foxp3+ Treg数目及CD39+Foxp3+/Foxp3+ Treg比例较癌旁明显增高，浸润数目与肝癌总体生存率相关。肝癌局部存在着CD39的高表达、广泛表达并与术后复发及总生存率相关。　　创新点　　1首次用分离出的肝癌及癌旁组织中的浸润淋巴细胞做全基因表达谱芯片，进一步分析两者的基因差异性表达，并筛选出与肝癌浸润淋巴细胞功能改变相关的差异表达基因予以验证，为进一步研究提供实验依据。　　2首次阐明肝癌内CD39+Foxp3+ Treg表达情况及与预后的关系;阐明CD39在肝癌内的表达情况及与预后关系。