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随着现在社会的不断进步,人们生活方式、饮食习惯以及环境因素的变化,我国乳腺癌发病率在近30年中每年约增长2%-3%,成为威胁女性健康的“头号癌症杀手”,卫生部已将乳腺癌列为我国肿瘤防治的重点之一。乳腺癌表现为乳房肿块、乳头溢液、乳头凹陷;乳头瘙痒、脱屑、糜烂、溃疡、结痂等乳头改变,形态上可以出现酒窝征、“橘皮征”等,并出现淋巴结肿大。乳腺癌容易出现远处转移,以肺、胸膜、骨、脑、肝转移多见。
随着miRNAs的发现及其在细胞内的作用机制不断深入研究,miRNAs在乳腺癌中的调控作用越来越受到重视,它能够调节肿瘤细胞的生长和侵袭、转移,在体内发挥着类似于癌基因和抑癌基因的作用。已经有实验在子宫内膜癌细胞系中证明MicroRNA-103促进肿瘤生长与侵袭的作用。本实验希望通过慢病毒介导的方法,将构建成功的pLVTHM-miR103载体转染到对人乳腺癌MCF7细胞,并对miR103是否靶向于Carm1进行初步鉴定,为后续的功能学研究打下基础,从而对最终的临床干预治疗提供一定参考价值。
目的:构建慢病毒载体pLVTHM-miR103,包装慢病毒,测定滴度,鉴定miR103对Carm1的靶向作用。
方法:实验分为三部分。1.通过文献挖掘找到在HER2(+)/(-)乳腺癌组织中表达不同的MicroRNAS,采用三种不同的生物信息预测软件对其靶向的基因进行预测,找到可能性最大的靶基因CARM1。2.扩增hsa-miR-103的前体片段,与pLVTHM同时经过XhoⅠ和NotⅠ双酶切,使用T4 DNA连接酶连接入pLVTHM质粒中,测序正确后,将目的片段转接于pLVTHM质粒,再次测序验证。构建好的质粒与PMD2.G、psPAX2两个辅助质粒使用脂质体2000导入293T细胞,包装出慢病毒。同时进行慢病毒滴度测定。3.pLVTHM-miR103慢病毒的获取及MCF7细胞中miR-103与融合基因CARM1靶向关系的初步鉴定。
结果:通过自行设计引物,以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR技术成功克隆了表达hsa-miR-103的基因片段,经测序验证正确;成功构建了表达hsa-miR-103的重组慢病毒质粒pLVTHM-miR-103,该重组质粒能在细胞内稳定特异地表达hsa-miR-103,并获取了慢病毒上清,具备再感染目的细胞的能力;利用所获得的慢病毒上清感染MCF7细胞,并利用实时荧光RT-PCR与westem blotting对感染后MCF7细胞中hsa-miR-103及CARM1表达情况进行了检测。
结论:根据目前实验结果尚不能断定hsa-miR-103与Carm1之间是否存在确定性靶向关系,仍需进一步优化实验条件并证明二者之间的靶向关系,但本研究可为进一步在乳腺癌中研究靶向融合基因Carm1的miRNAs提供技术和方法支持,有利于扩大研究其它更多的miRNAs在乳腺癌的发生发展中的机制作用,也可为最终的临床干预治疗提供一定参考价值。