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炎症反应在肿瘤发生、发展过程中起到一个双刃剑的作用。依据不同的肿瘤微环境,炎症反应可能促进肿瘤进展,也可能抑制肿瘤进展。肿瘤微环境对炎症反应的调控作用已经成为肿瘤免疫研究关注的热点。肿瘤内浸润的巨噬细胞在肿瘤相关炎症反应中发挥着主导作用。通常肿瘤中的巨噬细胞会被肿瘤微环境驯化为抗炎表型（M2型）,通过下调肿瘤免疫应答促进肿瘤生长、迁移和侵袭。如何重编程肿瘤微环境中的巨噬细胞,使其转变为增强肿瘤免疫的促炎表型（M1型）,已成为临床肿瘤免疫治疗的重要问题。抑癌基因p53在人类的多种肿瘤中表现为高频突变,而突变p53可获得癌基因的新功能,促进炎症相关肿瘤的发展。但是,不同p53突变体对肿瘤微环境中巨噬细胞的调控作用仍不清楚。为了探究肿瘤微环境下,不同p53突变状态对巨噬细胞炎症表型的调控作用,本课题从以下几个方面展开了研究:1、首先,通过比较分析野生型p53小鼠(p53+/+)、自发肿瘤的p53缺失小鼠(p53-/-)和自发肿瘤的p53N236S突变小鼠(p53S/S)体内炎症水平,我们发现:与p53+/+小鼠相比,p53-/-小鼠和p53S/S小鼠的肝脾组织中炎症相关因子TNFα、OSMR、c-Myc、Bcl-xl、Cyclin D1、p-STAT3、STAT3和ERK的表达升高。结果表明:p53-/-小鼠和p53S/S小鼠体内的炎症水平上调,提示p53功能失常状态在导致肿瘤发生、发展过程中还会伴随炎症水平的上调。2、进一步比较分析p53缺失突变和p53点突变这两种p53功能失常状态下的炎症水平,结果显示:首先,在细胞水平上,相比p53缺失背景的人肺癌细胞H1299,外源过表达了人类肿瘤热点突变p53R175H突变或p53R273H突变的H1299细胞表达更高水平的PPARγ和CSF1,已知这两个因子可诱导抗炎表型巨噬细胞（M2型）。此外,携带了p53R172H突变的小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEFs）中IL6/STAT3炎症信号通路的活化程度低于p53缺失突变的MEFs。这些数据表明携带了p53R175H/p53R273H/p53R172H突变的细胞中维持着更低的炎症水平,提示p53R175H/p53R273H/p53R172H突变体可能会在肿瘤微环境中对巨噬细胞表型的极化发挥一定程度的调控作用。与此同时,我们在p53缺失或p53R172H突变的MEFs中过表达了癌基因Ras,建立移植瘤小鼠模型,用于比较实体肿瘤中p53突变对巨噬细胞极化的影响。结果表明:相比p53缺失的肿瘤组织,携带p53R172H突变的肿瘤组织表达更低水平的炎症因子IL6以及M1表型标记物CCL3和i NOS,并且还表达更高水平的CSF1以及M2表型标记物CCL22、CD206和Arg1。而与p53缺失突变相比,携带p53R172H突变的细胞在小鼠皮下形成更大的肿瘤。这些数据表明携带了p53R172H突变的肿瘤组织中维持着更低的炎症水平,并含有更多的M2表型巨噬细胞。提示p53R172H突变体可能会促进肿瘤中巨噬细胞的M2表型极化,从而促进肿瘤的生长。以上结果表明:相比p53缺失突变状态,p53R175H/p53R273H/p53R172H突变蛋白可能通过诱导微环境中巨噬细胞的抗炎表型,维持低水平的炎症,从而获得更强的致瘤能力,促进肿瘤的发生、发展。3、为了研究不同p53突变状态对肿瘤微环境中巨噬细胞的诱导调控作用,我们收集肿瘤细胞上清培养巨噬细胞,以研究携带不同p53突变的肿瘤细胞分泌因子对巨噬细胞炎症表型的调控作用。结果表明:相比对照组,巨噬细胞经携带p53突变的H1299或MEFs细胞来源的条件培养基诱导后,巨噬细胞内M1型标记物TNFα、CCL3、IRF5和i NOS的表达显著下调,同时巨噬细胞的吞噬能力也被显著抑制。这表明:p53缺失突变或携带p53R175H/p53R273H/p53R172H突变的肿瘤细胞来源的条件培养基可诱导巨噬细胞的M2表型极化,提示p53突变可影响肿瘤细胞中因子的分泌,从而调控微环境内巨噬细胞的抗炎表型。进一步比较分析p53缺失突变或p53点突变状态对肿瘤微环境中巨噬细胞的炎症调控作用,发现携带了p53点突变如p53R273H/p53R172H的肿瘤可更显著地诱导M2表型的巨噬细胞。上述研究结果表明:p53功能失常状态的肿瘤进程伴随了炎症水平的上调。并且,p53突变可通过调控肿瘤细胞因子的分泌,从而诱导M2表型巨噬细胞。而p53点突变可更显著地诱导M2表型巨噬细胞,比p53缺失突变状态维持更低的炎症水平。基于这些原因,p53点突变如p53N236S/p53R172H表现出更强的致瘤能力。为了拮抗突变p53对巨噬细胞的M2表型诱导作用,接下来,我们对几种天然产物进行筛选。通过比较分析几种天然产物对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50),我们剔除了对肿瘤细胞毒性较大或对肿瘤细胞影响较小的天然产物,最终筛选出IC50值介于中间的天然产物姜黄素。为了排除姜黄素的直接抗肿瘤作用,我们进一步研究确定了姜黄素对肿瘤细胞增殖无明显抑制效果的浓度。通过使用该浓度的姜黄素处理肿瘤细胞,我们在体内外水平分别研究了姜黄素对重编程巨噬细胞的肿瘤细胞因子表达的调节作用。结果显示:1、低浓度姜黄素处理不同p53突变状态的肿瘤细胞后,我们发现姜黄素虽然不直接杀伤肿瘤细胞,但可抑制肿瘤细胞内的IL6/STAT3信号,下调PPARγ和CSF1的表达。已知STAT3信号在肿瘤进程中通常被异常激活,而STAT3、PPARγ和CSF1也可诱导M2抗炎表型巨噬细胞的极化。这提示低浓度姜黄素可对肿瘤细胞以及肿瘤微环境发挥炎症调节作用。进一步收集肿瘤细胞上清培养巨噬细胞后,我们发现:与肿瘤细胞来源的条件培养基相比,姜黄素处理过的肿瘤细胞来源的条件培养基可上调巨噬细胞中M1型标记物TNFα、IRF5、CCL3和i NOS的表达。这表明低浓度姜黄素可通过调节不同p53突变状态的肿瘤细胞的因子表达,改变肿瘤细胞炎症微环境,从而调控突变p53诱导的M2型巨噬细胞转变为M1型。2、为了验证姜黄素在体内的肿瘤炎症调节作用,接下来我们将姜黄素体外预处理的p53缺失突变或p53R172H突变的MEFs皮下成瘤免疫功能正常的小鼠。我们发现,姜黄素的应用抑制了不同p53突变状态的肿瘤组织中的IL6/STAT3信号,下调了肿瘤组织中PPARγ和CSF1的表达,上调了炎症信号NF-κB亚基RELB和p65的表达,同时也下调了M2型标记物CCL22、IRF4、CD206和Arg1的表达,并且显著地抑制了肿瘤的生长。这提示我们:姜黄素体外预处理不同p53突变状态的MEFs后,可改变荷瘤小鼠内的肿瘤炎症微环境,抑制突变p53诱导的M2表型极化,并最终抑制p53缺失MEFs和p53R172H MEFs的致瘤能力。综上所述:本研究阐明了p53功能失常的肿瘤进展过程中伴随着低水平炎症,且突变p53可通过调控肿瘤细胞中因子的表达,从而对巨噬细胞发挥M2表型诱导作用。此外我们的研究进一步阐明,p53点突变状态比p53缺失突变状态更显著地诱导M2表型巨噬细胞,维持更低的炎症水平,从而表现出更强的致瘤能力。而应用姜黄素可改变肿瘤炎症微环境,抑制突变p53诱导的M2表型巨噬细胞极化,并进一步抑制肿瘤的生长。本研究可为不同p53状态的肿瘤患者提供一种潜在的个性化肿瘤免疫治疗方案。