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第一部分 microRNAs在Ⅱ级和Ⅲ级脑胶质瘤中的差异表达及生物学功能分析 目的: 比较Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤中microRNAs表达的差异，对其中关键microRNAs进行生物学功能研究，从而揭示其在胶质瘤恶性进展中的作用。 方法: 1、采用芯片方法检测实验组107例胶质瘤组织标本（WHOⅡ级标本63例、Ⅲ级44例）的microRNAs表达差异。 2、对于在Ⅲ级胶质瘤组织中特异性表达的miR-374a及miR-544，在验证组（WHOⅡ级标本45例、Ⅲ级41例）中用实时荧光定量PCR方法分别检测其在组织和血清标本中的表达水平。 3、体外化学合成miR-374a mimics及miR-544 mimics，采用脂质体转染的方法将其转染到人胶质瘤H4细胞系，采用MTT实验、平板克隆形成实验检测其对细胞增殖能力的影响。 结果: 1、我们用芯片方法检测Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤标本中microRNAs的表达差异，结果发现，相对于Ⅱ级胶质瘤组织，在Ⅲ级胶质瘤组织中表达上调的包括miR-374a、miR-590-3p、miR-374b、miR-29c、miR-153等，而let-7c、miR-544、let-7a、miR-132、miR-7d等则表达下调。 2、我们分别挑选在Ⅲ级胶质瘤组织中表达升高及下降的miR-374a、miR-544，用实时荧光定量PCR法验证其在45例Ⅱ级、41例Ⅲ级胶质瘤组织中的表达水平，结果也与芯片方法一致，miR-374a在Ⅲ级组织中表达增高，miR-544在Ⅲ级组织中表达下降。但miR-374a、miR-544的表达水平在Ⅱ级、Ⅲ级血清标本中无明显差异，其在同一患者组织和血清标本中的表达水平均无相关性。 3、人胶质瘤H4细胞转染miR-374a mimics后，MTT结果显示细胞生长率明显增高，平板克隆形成实验结果显示细胞克隆数量明显增加。H4细胞转染miR-544 mimics后，细胞生长率明显降低，细胞克隆数量明显减少。 结论: 1、与Ⅱ级胶质瘤组织相比，Ⅲ级胶质瘤组织中miR-374a等表达上调，miR-544等表达下调，可成为胶质瘤恶性进展的分子标志物。 2、miR-374a、miR-544表达水平在Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤血清中无明显差异，尚不能成为胶质瘤恶性进展的血清标志物。 3、体外实验结果显示，miR-374a、miR-544通过调节细胞增殖能力影响肿瘤恶性进展。 第二部分 miR-196b通过诱导细胞增殖导致胶质母细胞瘤患者的不良预后 目的: 通过检测miR-196b在胶质瘤组织中的表达水平，探讨其与患者预后的关系及相关分子机制。 方法: 1、采用芯片方法检测实验组198例胶质瘤组织标本（WHOⅡ级标本63例、Ⅲ级44例、Ⅳ级91例）中miR-196b的表达情况。 2、在128例验证组标本（WHOⅡ级标本30例、Ⅲ级30例、Ⅳ级68例）中用实时荧光定量PCR方法检测miR-196b表达水平。 3、对于实验组和验证组的Ⅳ级胶质母细胞瘤患者，采用Kaplan-Meier方法进行生存分析。 4、对60例胶质母细胞瘤患者进行全基因组表达谱分析及基因集富集分析，以了解与miR-196b高表达相关的生物学过程。 5、体外化学合成miR-196b mimics，采用脂质体转染的方法将其转染到人胶质瘤U251细胞系，采用MTT实验、细胞周期实验、Westem blot实验检测其对细胞增殖能力的影响。 结果: 1、在198例实验组标本中，与Ⅱ级或Ⅲ级胶质瘤组织相比，Ⅳ级胶质母细胞瘤组织miR-196b表达水平明显增高，差异有统计学意义。 2、在包含128例标本的验证组中，miR-196b在胶质母细胞瘤组织中的表达高于Ⅱ级或Ⅲ级胶质瘤组织，差异有统计学意义。 3、Kaplan-Meier生存分析结果显示，对于实验组的91位胶质母细胞瘤患者，肿瘤组织中miR-196b表达水平越高，患者生存时间越短，预后越差;验证组的68位胶质母细胞瘤患者，肿瘤组织中miR-196b表达水平也与生存时间呈负相关。 4、为进一步了解胶质母细胞瘤患者中与miR-196b高表达相关的其他生物学过程，我们对60例胶质母细胞瘤标本进行了全基因组表达谱分析。结果发现，1294个基因与miR-196b表达有相关性，685个基因正相关，609个负相关;miR-196b表达与一些能促进细胞增殖的癌基因，如Ki-67、E2F1、EZH2等表达呈正相关，而与一系列抑癌基因，如CSRP1、DBC1、BIN1等表达呈负相关。GSEA结果显示，miR-196b高表达组富集到一些与细胞周期相关的基因集。以p＜0.001为有意义，胶质母细胞瘤标本中miR-196b高表达组富集到23个生物学过程，主要包括细胞周期进程、M期、有丝分裂、染色体分离等。 5、胶质瘤U251细胞转染miR-196bmimics后，细胞生长率明显增高，细胞周期S期比例增高，细胞表达E2F1蛋白增加。 结论: 1、与Ⅱ级或Ⅲ级胶质瘤组织相比，miR-196b在Ⅳ级胶质母细胞瘤组织中表达增高。 2、胶质母细胞瘤组织中miR-196b表达水平越高，患者生存时间越短，预后越差。 3、miR-196b可能通过诱导细胞增殖导致胶质母细胞瘤患者的不良预后。