研究背景异体复合组织移植是解决大面积创伤修复的可能手段之一，但是该领域主要的障碍是缺乏有效且副作用小的免疫耐受方案。临床中联合免疫抑制剂及异体造血干细胞移植诱导嵌合体形成是重要免疫耐受诱导方案之一，在异体心脏、肝脏、肾脏的移植中广泛应用。对于异体造血干细胞移植，到底是哪一群细胞诱导了免疫耐受，以及采取怎样的供体骨髓细胞输注途径以更好的诱导免疫耐受仍然没有定论。但值得注意的是，日本学者对骨内注射的研究，及近十年来美国及欧洲有关带蒂骨髓移植(VBMT)研究，均证实两者较静脉输注骨髓细胞更有效的诱导免疫耐受，并推测这可能与供体或者受体骨髓中造血细胞微环境更有利于供体细胞定植和分化有关。目前，活体示踪技术也发现供体来源的骨髓造血干细胞早期主要迁移到受体的骨内膜区域。同样，Haylock等利用酶消化的方法获取骨内膜区域的骨髓细胞（骨内膜骨髓细胞，Endosteal Bone Marrow Cells，EBMCs），与常规冲出的骨髓细胞(中央骨髓细胞，Central Bone Marrow Cells，CBMCs)进行比较，发现骨内膜骨髓细胞在诱导造血干细胞的生存及分化等能力，比中央骨髓细胞明显高。所以骨髓骨内膜区域及其中细胞也许在免疫耐受状态的诱导中具有重要的作用。实验目的通过酶消化的方法提取EBMCs，骨内注射输注到受体骨髓腔中，与静脉输注CBMCs和骨内注射CBMCs进行比较，观察各组异体皮片的存活时间，并检测脾脏及骨髓中的嵌合水平，以确定经过酶消化的EBMCs是否可以更好的诱导免疫耐受。利用RT-PCR比较经免疫耐受预处理（4.8Gy全身照射，腹腔注射雷帕霉素2mg/kg/d7d）的EBMCs注射组和CBMCs注射组的免疫耐受相关基因(CXCL-12，FOXP3，IL-10，TGF-β)的表达情况，探索其诱导免疫耐受的可能分子机制。最后，骨内注射CFSE标记的CBMCs及EBMCs，12小时后流式细胞术检测注射侧股骨骨髓腔、未注射侧股骨骨髓腔、两侧股骨骨内膜区域CFSE的强度，确定注射后早期异体细胞迁移的部位及比例，从而验证骨内膜骨髓细胞是否存在细胞归巢上的优势。实验方法本实验方法如下：1.将供体骨髓中的骨内膜区域骨髓细胞酶消化下来，通过骨内注射的方法直接输注到受体骨髓腔内，联合小剂量全身照射（4.8Gy）及小剂量雷帕霉素腹腔注射（2mg/kg/d7d）诱导免疫耐受，4周后植皮，比较骨内注射EBMCs、静脉输注或骨内注射CBMCs三者皮片存活时间，并进行脾脏和骨髓嵌合测定。2.筛选与造血干细胞迁移（CXCL-12）及调节性T细胞相关的基因（FOXP3，IL-10，TGF-β），利用RT-PCR比较正常小鼠骨髓EBMCs及CBMCs之间各基因RNA表达的差异；同时，于骨内注射CBMCs7周后，测定受体小鼠EBMCs及CBMCs的基因相对表达量，并与正常小鼠EBMCs及CBMCs分别比较；3.将供体小鼠的CBMCs及EBMCs用CFSE标记，注射到受体小鼠的一侧股骨骨髓腔，12小时后利用流式细胞技术观察注射侧股骨与未注射侧股骨骨内膜区域和骨髓腔区域的CFSE强度。实验结果骨内注射EBMCs较静脉输注和骨内注射CBMCs可以更好的延长异体皮片存活，但两者骨髓及脾脏中嵌合水平无明显差异。正常小鼠骨髓中，EBMCs的CXCL-12和与Tregs相关的IL-10及Foxp3均明显高于CBMCs (P <0.05)。但是经预处理及骨内注射后7周，CBMCs中的细胞因子或相关转录因子IL-10，Foxp3，TGF-β，SFPR均显著升高(P <0.05)，仅CXCL-12除外。而EBMCs仅IL-10明显升高，FOXP3、CXCL-12等降低(P <0.05)。预处理及骨内注射后EBMCs与CBMCs基因表达比较得相对表达数据，并与以上所得正常小鼠CBMCs-EBMCs相对表达数据比较，发现经过预处理及骨内注射小鼠仅仅CXCL-12较之正常小鼠降低(P <0.05)，FOXP3、IL-10等无显著变化。骨内注射CFSE标记的EMBCs及CBMCs12小时后，受体小鼠的双侧股骨骨内膜区域中CFSE荧光强度均高于骨髓腔中的CFSE强度(P <0.05)，而在未注射侧骨髓腔中注射EBMCs小鼠较注射CBMCs小鼠的CFSE强度高(P <0.05)。结论骨内注射骨内膜骨髓细胞较骨内注射及静脉输注中央骨髓细胞更好的延长异体皮片存活时间；骨内注射后，受体小鼠CBMCs及EBMCs的IL-10出现明显的表达升高，IL-10也许是免疫耐受诱导过程中的关键细胞因子；骨内注射异体骨髓细胞后早期（12小时），骨内膜骨髓细胞向外迁移的能力更强；骨内膜区域可能是早期异体骨髓细胞的主要定植区域。