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目的:本研究旨在探讨牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）感染与食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）自噬流发生发展的相关性。通过临床样本检测,体外细胞及体内动物实验阐述P.gingivalis可通过干预ESCC细胞中SNARE蛋白复合物聚合导致自噬体与溶酶体融合受阻,最终引起P.gingivalis发生自噬逃逸从而长期定植于ESCC细胞并促进食管鳞癌恶性进展的整体系统机制,为食管鳞癌病因学研究和临床防治策略的制定提供新的科学依据。方法:1.采用免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）检测179例食管鳞状细胞癌患者石蜡包埋的癌及相应癌旁组织中P.gingivalis感染及自噬相关蛋白p62的表达情况,并分析P.gingivalis与自噬相关蛋白SQSTM1/p62之间的潜在作用机制,及其与临床病理特征、5年生存预后的相关性。2.通过透射电子显微镜（Transmission electron microscopy）及免疫荧光法（Immunofluorescence,IF）检测P.gingivalis感染对食管鳞癌细胞自噬流的影响。在ESCC细胞中,利用单丹磺酰尸胺（Dansylcadaverine,MDC）染料标记自噬体,溶酶体红色荧光探针（Lysotracker-Red）标记溶酶体,并以自噬抑制剂三甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）及氯喹（Chloroquine,CQ）作为对照。3.利用自噬双标腺病毒GFP-RFP-LC3标记P.gingivalis感染后的ESCC细胞通过共聚焦显微镜对单个活细胞的荧光变化进行实时动态监测,以分析P.gingivalis感染不同时间对食管鳞癌细胞自噬流的影响。4.通过免疫印迹法（Western-blot）及免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测P.gingivalis感染对食管鳞癌细胞中自噬相关蛋白LC3、p62以及Beclin1表达量的影响及其与SNARE相关蛋白（SNAP29、VAMP8及STX17）间的互作情况,进一步探索P.gingivalis在食管鳞癌细胞中调节自噬流的具体机制。5.采用菌斑测定法（Plaque Assay）检测自噬启动基因ATG7及SNARE蛋白复合物对P.gingivalis在食管鳞癌细胞中定植率的影响。6.连续21天对C57小鼠口腔灌注P.gingivalis并将各组小鼠分为自噬抑制剂3-MA及CQ单药处理组及3-MA+CQ联合处理组,随后通过RNA Scope法及Taqman-q PCR法检测C57小鼠食管黏膜载菌量,进一步验证自噬对P.gingivalis在食管黏膜定植率的影响。7.收集P.gingivalis感染阳性的食管鳞癌患者经手术切除后的肿瘤标本,荷在BALB/c nude裸鼠皮下构建食管鳞癌Patient Derived Xenograft（PDX）小鼠模型,并分为化疗药紫杉醇（Paclitaxel）单药处理组、自噬抑制剂3-MA处理组以及3MA+Paclitaxel联合处理组,利用Western-Blot检测各组瘤体凋亡水平以分析自噬活性对P.gingivalis阳性的食管鳞癌患者化疗敏感性的影响,随后通过体外细胞实验再次验证自噬抑制剂3-MA对P.gingivalis感染后的食管鳞癌细胞化疗敏感性的影响。8.统计学分析:统计分析均采用SPSS26.0软件。计数资料一致性分析采用Cohen’s kappa分析,相关性分析采用χ~2检验;计量资料以均数±标准差（x±s）表示,两组以上组间差异比较采用单因素方差分析。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,Log-rank法分析各组生存时间的差异,Cox回归分析（单因素及多因素回归分析）用于筛选独立危险因素。生存时间为病理诊断为食管鳞状细胞癌日期至死亡或最后1次随访日期;随访周期为5年（60个月）;删失数据为存活满5年的患者,未删失数据为由ESCC疾病进展而引起死亡的患者。P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.在179例ESCC患者癌及癌旁组织中通过免疫组织化学法检测P.gingivalis感染及自噬蛋白p62表达情况,结果显示:在ESCC组织中,P.gingivalis感染及p62表达均高于相应癌旁组织,且二者呈显著正相关。P.gingivalis感染且p62高表达的ESCC患者往往伴随长期烟酒史、临床分期晚、分化程度低、淋巴结转移早和5年生存率较低等不良指标。2.透射电子显微镜结果显示:经P.gingivalis感染后,ESCC细胞质中产生大量自噬体,证实P.gingivalis感染能够引起ESCC细胞发生自噬;随后通过共聚焦显微镜进一步检测P.gingivalis感染对ESCC细胞自噬水平的影响,结果显示在P.gingivalis感染6h时,MDC与Lysotracker-Red共定位量显著多于P.gingivalis感染24h,且通过与自噬抑制剂3-MA和CQ作对比,初步证实P.gingivalis感染可引起ESCC细胞发生自噬,并随着其持续感染能够干预ESCC细胞自噬进程。3.通过共聚焦显微镜实时动态监测经自噬双标腺病毒GFP-RFP-LC3标记的单个ESCC细胞在P.gingivalis感染后的荧光水平变化,结果显示:在P.gingivalis感染初期（1-12h）能够引起自噬的发生且自噬活性较高,而随着P.gingivalis持续感染（12-24h）,自噬体与溶酶体融合量也持续减少,引起细胞质中大量自噬体累积,导致自噬流受阻。4.Western-blot结果显示:随着P.gingivalis持续感染,ESCC细胞中自噬相关蛋白LC3和p62表达量逐渐升高同时伴随着Beclin1蛋白表达水平逐渐降低,与临床样本及免疫荧光检测结果一致;而Co-IP结果则进一步证实P.gingivalis可通过干预SNARE复合物中SNAP29、VAMP8及STX17之间的互作而阻断SNARE复合物形成,导致ESCC细胞自噬流受阻。5.通过构建自噬启动基因ATG7及SNARE复合物中SNAP29基因缺失的ESCC细胞检测P.gingivalis在ESCC细胞中的定植率。Plaque Assay实验结果显示,与对照组及ATG7敲降组相比,SNAP29基因的敲降更有利于P.gingivalis在ESCC细胞中定植。6.采用RNA Scope法及Taqman-q PCR法检测C57小鼠食管黏膜载菌量,结果显示3-MA抑制剂能够显著抑制P.gingivalis在小鼠食管黏膜的定植;而与3-MA及3-MA+CQ联合处理相比,CQ抑制剂处理组P.gingivalis在小鼠食管黏膜定植量显著升高。7.收集P.gingivalis感染阳性的食管癌患者肿瘤建立PDX动物模型并利用Paclitaxel及3-MA干预,结果显示:与Paclitaxel单药处理组及3-MA处理组相比,3MA+Paclitaxel联合处理组小鼠瘤体体积最小、重量最轻且凋亡水平最高,在体外细胞实验中也再次得到验证。有效调节自噬活性可能是提高P.gingivalis感染阳性的食管癌患者化疗敏感性的重要手段。结论:P.gingivalis感染与ESCC的发生发展密切相关,本研究首次从自噬的角度展开P.gingivalis在ESCC中致病机制的研究。探明P.gingivalis可通过干预SNARE复合物聚合,诱发自噬逃逸而协助其在ESCC细胞中长期定植。进一步通过PDX动物实验证实有效调节自噬活性能够提高P.gingivalis阳性的ESCC患者对化疗药物的敏感性,为食管鳞癌病因学研究和临床防治策略的制定提供新的科学依据。