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龙眼（Dimocarpus longan Lour.）作为无患子科（Sapindaceae）龙眼属（Dimocarpus）热带/亚热带常绿木本果树,原产于我国福建、广东及东南亚等地区。龙眼果实鲜美多汁,富含多糖、生物碱及黄酮等活性物质,具有较高的营养价值。在自然条件下,龙眼胚胎发育的质量直接影响了龙眼果实的发育,若胚胎发育质量差,会导致果实坐果率低、落果严重及形成小果等。因此,对龙眼胚胎发生（embryogenesis）分子机制的研究能为提高果实的产量及品质提供理论依据。然而,龙眼合子胚发育早期取样困难,阻碍了对合子胚发育的分子机制的阐明。取而代之,龙眼体细胞胚胎发生（体胚发生,somatic embryogenesis,SE）系统已被用于龙眼离体胚胎发育的研究。先前的研究发现,龙眼胚性愈伤组织（embryonic callus,EC）中不但含有胚性细胞,还含有非胚性细胞,只有具有旺盛分裂能力的胚性细胞才具有体胚发生的潜能。目前,基于基因组测序、转录组测序及蛋白组测序等技术,已对龙眼SE过程分子机制进行了一定的研究。然而,这些发现是在有限的细胞群中对特定发育阶段基因表达谱进行分析分析的结果。而龙眼EC中胚性细胞及非胚性细胞分子调控的差异仍然未知。此外,龙眼体胚中的具体细胞类型尚不清楚。因此,本研究基于最近发展起来的高分辨率单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing,scRNA-seq）技术,对龙眼EC进行scRNA-seq。基于测序结果得到的不同细胞中的基因表达规律及功能注释结果,对龙眼EC的细胞类型进行分类及鉴定。同时筛选关键调控因子,验证它们在龙眼SE早期中的功能。主要研究结果如下:1龙眼胚性愈伤组织单细胞转录组测序分析对龙眼EC进行scRNA-seq,从两个生物学重复中分离得到28,724个单细胞用于分析。采用serurat软件对细胞进行无监督聚类,共得到12个细胞亚群（cluster）。选取每个cluster中上调表达倍数前20的基因作为每个cluster的标记基因,对其进行功能注释,结合已报道的不同细胞类型的标记基因,在龙眼EC中鉴定出5个cluster共4种细胞类型,包括增殖细胞（proliferating cell,PC,cluster 6及8）、分生细胞（meristematic cell,MC,cluster 9）、维管细胞（vascular cell,VC,cluster 7）及表皮细胞（epidermal cell,EPC,cluster 11）。结合bulk RNA-seq结果,对每个cluster中上调表达前20的基因在龙眼SE早期的表达模式进行分析,发现cluster 8及9的大部分标记基因在龙眼SE早期呈逐渐下调的表达趋势,表明这2个cluster可能为龙眼SE早期细胞群。而cluster 2、5、7及11的标记基因在龙眼SE早期呈逐渐上调的表达趋势,表明这4个cluster可能为龙眼SE分化期细胞群。挑选了已被鉴定细胞类型的、可能在龙眼SE过程中出现细胞分化的cluster 8、9、7及11进行拟时分析,发现cluster 8及9处于拟时间轴的起始位置,之后细胞连续分裂并分化为2个分支,一个分支为cluster 7的VC细胞群,另一个分支为cluster 11的EPC细胞群。结果表明龙眼胚性细胞在早期经历旺盛的连续不断的有丝分裂过程,之后逐渐分化为VC及EPC。对该细胞连续分化轨迹中上调表达的转录因子-靶基因调控网络进行分析,发现ETHYLENE RESPONSIVE FACTOR（ERF6）、ERF20、ERF114、MYB9、MYB4、NAC058及WRKY75等转录因子均在该细胞分化轨迹中活跃表达。进一步采用过表达瞬时转化龙眼原生质体技术,验证了NAC83-XTH23及NAC58-MYB9的正调控关系。此外,部分cluster的上调表达的基因富集在“细胞自噬”途径中,这些cluster中的细胞可能通过自噬调节以维持细胞稳态,或介导非胚性细胞凋亡。2龙眼AP2/ERF转录因子超家族全基因组鉴定及表达模式分析基于scRNA-seq的结果,发现了多个AP2/ERF转录因子可能参与调控龙眼EC的细胞分化过程,如ERF6、ERF20及ERF114等成员在单细胞转录组不同类型的细胞中显著上调表达。因此,对其所在的AP2/ERF转录因子超家族进行鉴定,共鉴定到125个龙眼AP2/ERF超家族成员。根据其保守结构域数量及种类的差异,进一步将这125个成员分为ERF、AP2、RAV及Soloist四个家族。基于bulk RNA-seq结果,对AP2/ERF转录因子超家族的表达模式进行分析,发现AP2/ERF成员在龙眼SE早期及不同组织中广泛表达,并能够响应不同光质、激素及温度。此外,在单细胞转录组中上调表达的ERF6及ERF20在球形胚（globular embryo,GE）阶段上调,ERF6还在高温胁迫中上调表达。3龙眼GPAT基因家族全基因组鉴定及表达模式分析基于scRNA-seq的结果,发现了2个GPAT家族成员GLYCEROL-3-PHOSPHATE ACYLTRANSFERASE（GPAT6.2）及GPAT8在EPC中特异表达,可能参与龙眼生长发育及抗逆境胁迫等生物学过程。因此,对其所在的GPAT家族进行鉴定,共得到9个龙眼GPAT家族成员。基于bulk RNA-seq结果,对GPAT家族的表达模式进行分析,发现GPAT家族成员在龙眼SE早期及不同组织中广泛表达,并能够响应不同光质及温度。测定了龙眼SE早期三酰甘油（triacylglycerol,TAG）的含量变化情况,发现龙眼SE早期TAG含量呈逐渐上升的变化趋势,广靶代谢组学测定进一步验证了该结果。此外,在单细胞转录组中上调表达的GPAT6.2及GPAT8在GE阶段上调表达,并在高温胁迫中上调表达,表明它们可能在龙眼中发挥重要功能。4 AP2/ERF-GPAT调控网络的验证及其在高温胁迫下的龙眼体胚发生早期的表达模式分析对龙眼AP2/ERF-GPAT转录因子-靶基因调控网络进行预测,共有73个AP2/ERF转录因子可能调控9个GPAT家族基因。在单细胞转录组中上调表达的ERF6可能调控整个GPAT家族基因的表达。将ERF6过表达瞬时转化龙眼原生质体,发现ERF6能够激活大部分GPAT家族基因的表达。双荧光素酶试验结果显示ERF6能激活GPAT6.2及GPAT8的启动子活性,表明ERF6为GPAT6.2及GPAT8的激活子。为进一步研究ERF6及GPAT家族基因在高温胁迫下的龙眼体胚中的响应情况,对龙眼SE早期进行高温（35℃）胁迫处理。结果显示高温抑制了龙眼体胚的分化,高温处理下龙眼体胚无法分化为GE。高温胁迫激活了ERF6及GPAT家族基因的表达,在第9 d激活最显著。对高温胁迫下龙眼SE早期TAG含量变化进行测定,发现高温胁迫第6及9 d时,TAG含量显著上升,表明TAG也参与了龙眼高温胁迫过程。该结果表明ERF6可能通过激活GPAT家族基因的表达,参与龙眼体胚TAG的生物合成,从而参与龙眼体胚对高温胁迫的响应。5 ERF6稳定转化龙眼胚性愈伤组织的功能研究采用农杆菌介导的遗传转化法将ERF6过表达稳定转化龙眼EC,研究ERF6在龙眼体胚中的功能。结果显示,过表达ERF6后GPAT家族大部分基因显著上调表达,且过表达ERF6的龙眼EC中TAG含量显著升高,表明ERF6能在龙眼EC中通过激活GPAT家族基因的表达,从而参与TAG的生物合成。将筛选后的ERF6阳性EC转接至MS培养基进行体胚发生观察,结果显示过表达ERF6后龙眼EC能够正常进行体胚发生。此外,过表达ERF6抑制了龙眼体胚在高温胁迫下的分化过程,高温胁迫下过表达ERF6的龙眼体胚中TAG含量显著上升,且ERF6在高温胁迫下亦能够激活GPAT家族基因的表达。外源添加褪黑素（Melatonin,MT）后高温胁迫下过表达ERF6的龙眼体胚中的TAG含量下降,过表达ERF6导致的龙眼体胚在高温胁迫下的细胞解体现象消失。结果表明高温胁迫下ERF6通过激活GPAT家族基因的表达,促进了龙眼体胚TAG的生物合成,抑制了龙眼体胚分化。