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目的 胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)是在机体发育过程中存在的具有自我增殖、更新能力,且能形成各种类型分化细胞的一类细胞。利用ES细胞便于进行神经细胞发育和分化研究。若对干细胞进行适当诱导,得到特定类型的神经细胞,对损伤与病变的细胞予以补充,将使干细胞成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的最佳来源。因而诱导干细胞分化为神经细胞,不论在理论研究还是在临床应用上已成为研究热点。 ES细胞来源于着床前囊胚期内细胞团(inner cell mass,ICM),具有发育全能性。维甲酸(retinoic acid,RA)作为一种非特异性的诱导剂被广泛用于ES细胞诱导研究中。 未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)最早发现于酵母,是一种从内质网到细胞核的细胞内信号转导通路。当内质网腔内未折叠蛋白增多时,通过Irelp胞质面部分的丝氨酸/苏氨酸自磷酸化,诱导UPR特异性转录因子Haclp mRNA剪接成熟。最终将信号传导到细胞核内,启动内质网分子伴侣的表达。哺乳动物基因组含两个IRE1同源体—IRE1α和IRE1β。从鼠基因组剔除Ire1α会导致胚胎在10.5天死亡。在哺乳动物组织中Ire1/Xbp途径的作用是促进分化。近来发现,UPR信号通路可促进具有分泌抗体功能的浆细胞的分化。但它在神经发育方面的作用还未见报道。 ES细胞被诱导分化实验中,所用诱导物质种类繁多,诱导模式也不尽相同。虽然RA诱导能得到较大量的神经元,但由于在RA诱导前需形成拟胚体(embryonic bodies,EBs),其中含有许多不同种细胞,这使每步分化难于分析和控制,而且EBs内细胞间相互作用也能诱导出神经样细胞。其次,RA是一种强的致畸物,会干扰神经元的样式和性质,因此诱导得到的神经细胞与正常相比还存在差异。因而,利用ES细胞定向诱导分化方法产生单一类型的分化细胞具有重大的意义。对ES细胞转染专一的转录因子,标志基因或有关细胞分化因子等遗传操作并结合报告基因和诱导条件选择是一条可能的探索ES细胞定向诱导分化的途径。目前多转染已知的在神经发育过程中表达的特异性基因。 本研究室陈誉华教授曾经分离鉴定到一个与大肠杆菌侵袭脑微血管内皮细胞、穿越血脑屏障(Blood Brain Ba示er,BBB)相关的基因一ibeB(呈nva-sion of互rain旦ndotheli吐eellsB)。该基因的开放读码框(open reading fiame,ORF)为1383bp,编码蛋白的大小为50KD,大肠杆菌ibeB基因编码的50KD前体蛋白经分子内剪切加工形成大小为34KD的成熟表达产物,定位于细胞外膜。通过与GeneBank比对发现,在人、鼠、水稻基因组中都存在与ibeB基因高度同源的DNA序列。人以及小鼠胚胎组织中存在与之高度同源的EST序列,说明人以及其它高等动物中可能存在大肠杆菌ibeB基因的同源基因。这些同源体基因至今仍未克隆鉴定,它们的起源以及在真核细胞中所负担的功能尚不清楚。本研究室陈澄曾经将克隆有ibeB基因的真核表达载体转染HeU细胞,使转基因细胞株呈现完全不同于HeLa细胞的神经样改变,这些神经样细胞为GFAP表达阳性,提示ibeB基因可能具有诱导He压细胞向神经胶质细胞分化的作用。 本研究的目的在于以RA诱导ES细胞,在体外模拟神经细胞分化过程建立模型,初步探索UPR通路在此神经分化模型中的作用。根据£beB基因在HeU细胞中作用的现象,进一步观察ibeB基因在ES细胞分化过程中的作用。同时对ibeB蛋白在转基因细胞中的亚细胞定位进行研究,对ibeB基因诱导神经样细胞分化的功能做初步探索。以期为阐明神经细胞分化机制和ES细胞向神经细胞的定向分化积累科学资料。方法 (一)以诱导ES细胞分化模型的建立及鉴定 1.悬滴培养ES细胞形成EBs,之后用RA诱导细胞分化。 2.透射电镜观察有/无RA诱导时分化细胞超微结构变化。 3.免疫细胞化学方法鉴定神经细胞特异性分子一神经特异性烯醇化酶(n~n一sPec迅。endolase,NSE)和胶质细胞特异性分子一胶质纤维酸性蛋白(glia filament aeidie protein,GFAp)的表达。 4.RT一PCR方法鉴定神经细胞特异性基因—巢蛋白(nestin)和神经丝蛋白M(neur日filamentM)的时序性表达。 (二)UPR途径分子在由RA诱导Es细胞得到的神经细胞分化初步模型中作用的研究 1 .RT一PCR方法检测UPR途径分子Irela的表达。 2.Westem Blot方法检测UPR途径分子liela、葡萄糖调节蛋白78(砂ucosere脚ated protein 78,Grp78)、葡萄糖调节蛋白94(咖eose re列atedProtein94,卿94)的表达。 (三)稳定转染ibeB基因的ES细胞株的建立 1.以连接有ibeB基因的质粒peDNA3 .1作载体,电转方法对ES细胞进行转染,以18进行筛选。 2.RT一PCR方法鉴定iboB基因的插人和表达。 (四)转染细胞的生物学特性鉴定 1.转染细胞形态观察。 2.RT一PCR方法鉴定NF一M、神经丝蛋白H(neur习filamentH,NF-H)和nestin的表达。 3.Westem Blot方法鉴定nestin和GFAP的表达。 4.免疫细胞化学方法鉴定nestin的表达。 (五)ibeB蛋白亚细胞定位的研究 1.重组质粒pR