论文部分内容阅读
屎肠球菌是仔猪生产中常用的益生菌,但是其作用机理尚不清楚。为了更充分地了解屎肠球菌对仔猪小肠黏膜先天防御屏障功能的影响,本研究用屎肠球菌活菌和热灭活菌对新生仔猪进行试验,并研究它们对猪肠上皮细胞的影响。动物试验选用窝产仔数和体重相近、胎次和出生时间相同的9窝仔猪,随机分为3个组,每组3窝仔猪。从出生开始,对照组、活菌组和灭活菌组仔猪就分别灌服10%的脱脂乳溶液、含益生屎肠球菌活菌（1×108cfu/mL）的10%脱脂乳溶液和含热灭活屎肠球菌（1×108cfu/mL）的10%脱脂乳溶液各10 mL,每天一次,连续6天,仔猪7日龄开始饲喂教槽料,21日龄断奶。记录仔猪出生、7日龄以及21日龄体重,并统计教槽前和断奶前的腹泻率,并在7日龄饲喂教槽料之前,每窝选择一头中等体重的仔猪屠宰,采集肠粘膜样本,分析相关指标。细胞试验采用猪空肠上皮细胞系IPEC-J2细胞,设5个处理,每个处理6个重复。细胞培养在37℃,5%CO2恒温培养箱中,在IPEC-J2细胞生长交汇后,对照组、LPS组、活菌组、灭活菌组和细胞壁组分别在无抗无血清培养基中加入PBS、LPS（1 ng/mL）、益生屎肠球菌活菌（1 × 108cfu/mL）、热灭活屎肠球菌（1×108cfu/mL）和细胞壁（100μg/mL）,与 IPEC-J2 细胞共孵育 12 h,分别在1、3、6和12 h收集细胞培养上清和细胞裂解液,并测定相关指标。主要试验结果如下:1.益生屎肠球菌活菌及其热灭活菌都不影响哺乳期仔猪的体增重,但都能大幅度降低仔猪的腹泻率,而且活菌组脾脏指数下降显著（p<0.05）。益生屎肠球菌活菌显著上调空肠和回肠黏膜的Zo-1基因表达（P<0.05）,不影响occludin基因表达;但空肠黏膜的occludin和Zo-1基因表达不受热灭活菌影响,回肠黏膜的这两种紧密连接蛋白显著下调（p<0.05）。Western blot结果显示,益生屎肠球菌活菌与热灭活菌都可提高空肠和回肠黏膜occludin和claudin的蛋白表达。与IPEC-J2共培养3h内,屎肠球菌活菌、热灭活菌以及其细胞壁都能上调zo-1、occludin的表达水平（p<0.05）,活菌和灭活菌还上调了共孵育1h的clauaine表达水平（p<0.05）,当共培养时间长达6h以上时,紧密连接蛋白的表达都下调（p<0.05）,而LPS对这三种紧密连接蛋白的基因表达即使在共培养3h内也基本都是显著下调作用（p<0.05）。Western blot结果显示,在3h内,屎肠球菌活菌可上调occludin和claudin的蛋白表达水平,热灭活菌和细胞壁组在lh内上调claudin的蛋白表达量,3h时与对照组相比差异不显著,6h时活菌与热灭活菌的紧密连接蛋白表达量都趋于下降,而LPS组从lh开始就下调occludin和claudin的蛋白表达水平,蛋白表达与基因表达基本一致。2.屎肠球菌活菌显著上调仔猪空肠黏膜的il-1、il-6、il-8、tnf-α和tgf-βmRNA表达水平（p<0.05）,但是显著下调仔猪回肠黏膜的il-1、il-6、il-12和tgf-β的表达水平（p<0.05）,不影响空肠黏膜的i1-12和回肠黏膜的il-8和tnf-α的表达量。与活菌不同,热灭活菌组的空肠黏膜的i l-1、il-6、i1-8、i1-12、tnf-α 和回肠黏膜的 il-6、1l-8、il-12 mRNA表达水平都显著下调（p<0.05）,而空肠黏膜的tgf-β和回肠黏膜的il-1、tnf-α、tgf-β的表达量则不变。屎肠球菌活菌和热灭活菌对仔猪小肠黏膜细胞因子分泌的影响也有差别。活菌显著促进空肠黏膜和回肠黏膜TGF-β以及回肠黏膜IL-8的分泌（P<0.05）,不影响空肠黏膜IL-8、空肠和回肠黏膜IL-10和TNF-α的分泌量。而热灭活菌组的空肠黏膜IL-10和TGF-β的分泌量都明显增加（p<0.05）,回肠黏膜IL-8、TNF-α和TGF-β的分泌量却都显著下降（p<0.05）,但是空肠黏膜IL-8、TNF-α和回肠黏膜IL-10的分泌量不受影响。与IPEC-J2共培养lh时,屎肠球菌活菌显著上调il-1、il-8、tn-α和tgf-βmRNA的表达量（p<0.05）,但il-6和il-12mRNA的表达水平被显著抑制（p<0.05）;热灭活菌只显著上调了 il-6、i1-8和tgf-βmRNA的表达水平（p<0.05）,而il-1、il-12和tnf-α都不受影响;细胞壁仅仅显著下调了 i1-8和tnf-α mRNA的表达量（p<0.05）,对il-1、il-6、i1-12和tgf-β不影响。当共培养时间达到3h时,屎肠球菌活菌则显著上调il-1、il-6、il-8和tnf-α mRNA的表达量（p<0.05）,热灭活菌显著促进1l-1、i1-6、il-8和il-12的表达（p<0.05）,细胞壁使得i1-6和il-12 mRNA的表达量显著增加（p<0.05）,但是却显著抑制tnf-α的表达（p<0.05）。不管共孵育1h还是3h,屎肠球菌活菌都显著刺激工PEC-J2细胞分泌TGF-β,但却显著抑制IL-8和IL-10的产生,不影响TNF-α的浓度。而热灭活菌与IPEC-J2共孵育时,只是显著增加1h的TGF-β分泌量,但对3h的没有影响,并显著减少共孵育1h和3h的工L-8和IL-10产量,对TNF-α也没有影响。3.屎肠球菌活菌组仔猪空肠黏膜的TLR-2和TLR-4以及回肠黏膜的TLR-9基因表达都显著上调（p<0.05）,但是空肠黏膜的TLR-9以及回肠黏膜TLR-2和TLR-4基因的表达水平都不受影响;而热灭活菌组仔猪空肠黏膜和回肠黏膜的TLR-4以及回肠黏膜的TLR-9基因表达都显著下调（p<0.05）,但是不影响空肠和回肠黏膜TLR-2以及空肠黏膜的TLR-9基因的表达。与IPEC-J2共培养3h时,屎肠球菌活菌组和细胞壁组的TLR-2表达量都显著增加（p<0.05）,但TLR-9的表达不受影响,而热灭活菌组和LPS组则都显著减少TLR-9的表达量（p<0.05）,但不影响TLR-2的表达;活菌组、热灭活菌组以及LPS组都促进TLR-4的表达（p<0.05）,但是细胞壁却显著抑制TLR-4的表达（p<0.05）。结论:益生屎肠球菌的活菌和热灭活菌有相似的益生作用（减少仔猪腹泻）,但是它们对仔猪小肠黏膜先天防御屏障的调节作用不完全一样:活菌增强仔猪小肠黏膜（包括猪肠上皮细胞）紧密连接蛋白的表达,并活化小肠黏膜（包括猪肠上皮细胞）的TLR2,4,9,诱导以耐受为主导的免疫应答;而热灭活菌只能促进猪肠上皮细胞表达紧密连接蛋白和TLR-4,但是也能诱导仔猪小肠黏膜产生耐受为主体的应答。