附子为毛莨科植物乌头（Aconitmn Cadnicadi Debx）的旁生块根（子根）,自古被誉为“回阳救逆第一要药”。在现代临床中,附子常用于救治急性心肌梗塞所致的休克、低血压状态、冠心病、风心病和多种疑难疾病,表现出良好的治疗效果。然而附子的显著疗效与毒性作用并存。其毒性主要表现为中枢神经系统和心血管系统,心脏不良反应最为明显[1],表现为窦性心动过缓、房室传导阻滞,严重者可出现室性心律失常,甚至心室纤颤,病人常因心律失常及呼吸中枢麻痹死亡。其所含的乌头碱（Aconitine,AC）,新乌头碱（Mesaconitine,MA）和次乌头碱（Hypaconitine, HA）是导致心律失常的主要原因。我们前期研究发现,将Beagle犬麻醉后,十二指肠给予附子水煎液,动物出现明显的室性心律失常,取此时含药血清稀释后给稳态表达hERG通道的HEK293细胞灌流, hERG通道电流可明显地抑制,对附子所含的主要生物碱成分Aconitine做进一步研究,发现Aconitine 3×10-7mol/L可使离体豚鼠乳头肌的动作电位的形状发生“三角变”,并伴自发性动作电位,而且Aconitine也可浓度依赖性的抑制hERG通道电流,其IC50为20μM。Aconitine抑制hERG电流的浓度是其可诱发豚鼠动作电位发生形状改变时所用浓度的近100倍,由此推测hERG通道并非Aconitine最敏感的作用靶点,Aconitine只有在高浓度才会抑制hERG通道进而导致QT间期延长。那么附子中其它生物碱成分是否会对hERG通道敏感?附子所含生物碱成分吸收入血后,药物血清对动作电位时程（Duration of AP,APD）会有何影响?为了阐明上述问题,我们拟用附子水煎液给大鼠灌胃,待出现明显心律失常时取血,分离血清,一部分在组织水平观察对离体豚鼠乳头肌动作电位的影响,一部分用于血清中成分分析测定,并以新乌头碱（Mesaconitine）为研究对象,分析其致心律失常机制,以期对于附子的开发应用有所价值,并为建立新药临床前评价,尤其是心脏安全性评价有所帮助。1附子提取液对大鼠心电图的影响目的:观察大鼠连续灌胃给予中药附子的水提液后,动物心电图的变化,并确认发生明显室性心律失常后取血以备下一步研究。方法: SD大鼠20只,随机分成两组,分别灌胃给予附子水提液1ml/100g和灭菌水,每日上、下午各给药一次,分别于药前和药后1、3、5天用RM6240CD型多道生理信号采集处理系统记录麻醉后大鼠心电图。结果:对照组大鼠麻醉前后心电图各参数无明显变化（p>0.05）,附子提取液组大鼠,给药1天时心电图T波值增大,与药前或对照组同期比较有显著变化（p<0.01）,其它指标无明显变化。给药3天时,30%的动物出现阵发性室性心早搏,70%动物出现二联律或三联律,与药前比较心率（HR）明显加快（p<0.01）,QRS波群宽大畸形（p<0.05）,T波值明显增大（p<0.01）、QT间期明显延长（p<0.01）、QTc明显延长（p<0.01）,PR间期明显缩短（p<0.05）。给药5天时动物心电图显示:部分动物由室性早搏、室性联律发展成室性心动过速、心室纤颤,发生率分别为10%、40%、30%、20%。给药前及给药5天时测量血清中电解质各组分变化,Na⁺、K⁺及Cl-浓度均有升高趋势,其中K+升高最明显与药前比有显著差异（p<0.05）,而Na+及Cl-的升高未见统计学显著性（p>0.05）,血中肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量有升高趋势,但与对照组比较无显著区别（p>0.05）。结论:大鼠灌胃给予附子水煎液,随着给药时间延长,逐渐出现QT间期延长、室性早搏、三联律及典型的室速、室颤等逐步严重心律失常反应。2附子药物血清对心肌动作电位的影响及成分分析目的:观察豚鼠乳头肌标本体外灌流不同浓度的附子药物血清后,动作电位的变化,分析其可能的机制,并用液-质仪检测其中生物碱成分。方法:健康成年雌性豚鼠,体重250³50g,取右心室乳头肌,用O₂饱和的台氏液恒温（36℃）、恒速（4 ml/min）灌注,用标准玻璃微电极技术记录豚鼠乳头肌动作电位,在1Hz的刺激频率下,分别加入稀释不同比例的药物血清,观察给药前及给药20min时AP各参数的变化。结果:（1）在1.0Hz刺激频率下,空白血清稀释30倍加入灌流系统,给药前后APD₃₀、APD₅₀、APD₉₀及V_max变化无统计学意义（P>0.05）。将体外给药3天的大鼠血清稀释3×10²倍加入到灌流系统对APD没有明显影响,稀释10²倍及30倍时,APD₉₀由给药前203±6ms延长至225±9ms及238±12ms,APD90-30由给药前103±4ms延长至119±6ms及133±5ms,与给药前比较均显著延长（p均<0.01）,稀释3×10²倍时对APD没有显著影响。体外给药5天的大鼠血清稀释10⁴倍、103^倍时,动作电位图形并无明显影响,稀释10²倍,动作电位图形明显增宽,动作电位时程明显延长（p<0.01）。APD₉₀由给药前170±8ms延长至221±19ms,APD_90-30由给药前106±6ms延长至143±4ms,动作电位超射值（OS）显著增大（p<0.05）。比较给药3天和5天的同浓度的药物血清,5天的药物血清引起的变化率[（药后-药前）÷药前×100%],明显高于3天的血清变化率（p<0.05）。（2）附子药物血清经HPLC-MS检测,主要检测到乌头碱（Aconitine）,新乌头碱（Mesaconitine）,次乌头碱（Hypaconitine）而草乌甲素（Bulleyaconitine A）和高乌甲素（Lappaconite）均未测出。结论:空白血清对豚鼠乳头肌动作电位变化无影响,附子药物血清中含有乌头碱、新乌头碱和次乌头碱,稀释10²倍的含药血清及更高浓度可延长动作电位时程和超射值,且其作用随体外给药的时间延长作用更明显。3新乌头碱对心肌动作电位及心肌细胞内钙的影响目的:观察新乌头碱对豚鼠乳头肌动作电位的影响,并从心肌细胞内钙和hERG电流的角度对其可能的作用机制进行分析。方法:（1）用标准玻璃微电极技术记录豚鼠乳头肌的动作电位,在1Hz的刺激频率下,MA在10^-10、10^-9、10^-8及3×10^-8mol/L终浓度时,观察给药前后AP的变化。（2）观察不同刺激频率下（0.3Hz,1Hz和3Hz）3×10^-8mol/L浓度时,给药前后APD₉₀的变化及计算其变化百分率。（3）酶解法分离豚鼠心室肌细胞,负载Fluo4-AM,激光共聚焦技术检测细胞内Ca²⁺离子浓度([Ca²⁺i)的荧光强度（FI）,结果以给药前后相对荧光密度（FI -FI0）/FI₀×100表示。给予不同浓度的新乌头碱,观察新乌头碱对心室肌肌[Ca²⁺]i的影响。（4）在稳态表达hERG通道的HEK293细胞株上,用全细胞膜片钳技术记录hERG电流,观察高浓度(10^-5)MA对hERG电流的影响。结果:（1）在1.0Hz刺激频率下,10^-10、10^-9 mol/L的MA对AP各参数无明显影响。当浓度增大至10^-8 mol/L时,APD₉₀由给药前190.6±4.6ms缩短至177.2±6.9ms,此变化有统计学意义（p<0.05）。并且随MA浓度增加,动作电位时程进一步缩短,振幅变小,3×10⁽-80mol/L时出现自发性动作电位,APD50及APD90缩短更加明显（p<0.05）,APD₉₀ 由给药前190.6±4.6ms缩短至166±4.7ms,但是APD_90-30反而延长（p<0.05）。（2）0.3、1、3Hz不同频率刺激时,3×10^-8mol/L MA延长APD90-30作用呈现反向频率依赖性。（3）10^-10、10^-9、10^-8mol/L的MA可浓度依赖性升高[Ca²⁺]i,在含钙台式液中,胞内钙荧光强度可分别升高24.3%,54.8%,129.2%,无钙台式液中升高18.6%、49.5%、91.5%。在含钙和无钙台式液中Ryanodine(10_-5mol/L)抑制了MA(10_-90mol/L升高胞内钙的作用,荧光强度分别由53.0%、41.5%下降至45.3%和13.5%。（4）MA (10_-5mol/L)对hERG电流无明显影响。结论:MA影响APD,诱发乳头肌出现自发性动作电位,主要原因与升高心室肌[Ca2+]i有关,而与hERG通道无关。MA延长APD_90-30作用与附子药物血清作用相同,不同的是APD₉₀和APD₃₀表现不一样,其原因有待进一步分析。总结:附子所含的新乌头碱通过调节钙通道活性而非hERG通道相对延长了APD90-30,是引起大鼠心律失常,尤其是QT间期延长的原因之一。