论文部分内容阅读
附子为毛莨科植物乌头(Aconitmn Cadnicadi Debx)的旁生块根(子根),自古被誉为“回阳救逆第一要药”。在现代临床中,附子常用于救治急性心肌梗塞所致的休克、低血压状态、冠心病、风心病和多种疑难疾病,表现出良好的治疗效果。然而附子的显著疗效与毒性作用并存。其毒性主要表现为中枢神经系统和心血管系统,心脏不良反应最为明显[1],表现为窦性心动过缓、房室传导阻滞,严重者可出现室性心律失常,甚至心室纤颤,病人常因心律失常及呼吸中枢麻痹死亡。其所含的乌头碱(Aconitine,AC),新乌头碱(Mesaconitine,MA)和次乌头碱(Hypaconitine, HA)是导致心律失常的主要原因。我们前期研究发现,将Beagle犬麻醉后,十二指肠给予附子水煎液,动物出现明显的室性心律失常,取此时含药血清稀释后给稳态表达hERG通道的HEK293细胞灌流, hERG通道电流可明显地抑制,对附子所含的主要生物碱成分Aconitine做进一步研究,发现Aconitine 3×10-7mol/L可使离体豚鼠乳头肌的动作电位的形状发生“三角变”,并伴自发性动作电位,而且Aconitine也可浓度依赖性的抑制hERG通道电流,其IC50为20μM。Aconitine抑制hERG电流的浓度是其可诱发豚鼠动作电位发生形状改变时所用浓度的近100倍,由此推测hERG通道并非Aconitine最敏感的作用靶点,Aconitine只有在高浓度才会抑制hERG通道进而导致QT间期延长。那么附子中其它生物碱成分是否会对hERG通道敏感?附子所含生物碱成分吸收入血后,药物血清对动作电位时程(Duration of AP,APD)会有何影响?为了阐明上述问题,我们拟用附子水煎液给大鼠灌胃,待出现明显心律失常时取血,分离血清,一部分在组织水平观察对离体豚鼠乳头肌动作电位的影响,一部分用于血清中成分分析测定,并以新乌头碱(Mesaconitine)为研究对象,分析其致心律失常机制,以期对于附子的开发应用有所价值,并为建立新药临床前评价,尤其是心脏安全性评价有所帮助。1附子提取液对大鼠心电图的影响目的:观察大鼠连续灌胃给予中药附子的水提液后,动物心电图的变化,并确认发生明显室性心律失常后取血以备下一步研究。方法: SD大鼠20只,随机分成两组,分别灌胃给予附子水提液1ml/100g和灭菌水,每日上、下午各给药一次,分别于药前和药后1、3、5天用RM6240CD型多道生理信号采集处理系统记录麻醉后大鼠心电图。结果:对照组大鼠麻醉前后心电图各参数无明显变化(p>0.05),附子提取液组大鼠,给药1天时心电图T波值增大,与药前或对照组同期比较有显著变化(p<0.01),其它指标无明显变化。给药3天时,30%的动物出现阵发性室性心早搏,70%动物出现二联律或三联律,与药前比较心率(HR)明显加快(p<0.01),QRS波群宽大畸形(p<0.05),T波值明显增大(p<0.01)、QT间期明显延长(p<0.01)、QTc明显延长(p<0.01),PR间期明显缩短(p<0.05)。给药5天时动物心电图显示:部分动物由室性早搏、室性联律发展成室性心动过速、心室纤颤,发生率分别为10%、40%、30%、20%。给药前及给药5天时测量血清中电解质各组分变化,Na+、K+及Cl-浓度均有升高趋势,其中K+升高最明显与药前比有显著差异(p<0.05),而Na+及Cl-的升高未见统计学显著性(p>0.05),血中肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量有升高趋势,但与对照组比较无显著区别(p>0.05)。结论:大鼠灌胃给予附子水煎液,随着给药时间延长,逐渐出现QT间期延长、室性早搏、三联律及典型的室速、室颤等逐步严重心律失常反应。2附子药物血清对心肌动作电位的影响及成分分析目的:观察豚鼠乳头肌标本体外灌流不同浓度的附子药物血清后,动作电位的变化,分析其可能的机制,并用液-质仪检测其中生物碱成分。方法:健康成年雌性豚鼠,体重250350g,取右心室乳头肌,用O2饱和的台氏液恒温(36℃)、恒速(4 ml/min)灌注,用标准玻璃微电极技术记录豚鼠乳头肌动作电位,在1Hz的刺激频率下,分别加入稀释不同比例的药物血清,观察给药前及给药20min时AP各参数的变化。结果:(1)在1.0Hz刺激频率下,空白血清稀释30倍加入灌流系统,给药前后APD30、APD50、APD90及Vmax变化无统计学意义(P>0.05)。将体外给药3天的大鼠血清稀释3×102倍加入到灌流系统对APD没有明显影响,稀释102倍及30倍时,APD90由给药前203±6ms延长至225±9ms及238±12ms,APD90-30由给药前103±4ms延长至119±6ms及133±5ms,与给药前比较均显著延长(p均<0.01),稀释3×102倍时对APD没有显著影响。体外给药5天的大鼠血清稀释104倍、103倍时,动作电位图形并无明显影响,稀释102倍,动作电位图形明显增宽,动作电位时程明显延长(p<0.01)。APD90由给药前170±8ms延长至221±19ms,APD90-30由给药前106±6ms延长至143±4ms,动作电位超射值(OS)显著增大(p<0.05)。比较给药3天和5天的同浓度的药物血清,5天的药物血清引起的变化率[(药后-药前)÷药前×100%],明显高于3天的血清变化率(p<0.05)。(2)附子药物血清经HPLC-MS检测,主要检测到乌头碱(Aconitine),新乌头碱(Mesaconitine),次乌头碱(Hypaconitine)而草乌甲素(Bulleyaconitine A)和高乌甲素(Lappaconite)均未测出。结论:空白血清对豚鼠乳头肌动作电位变化无影响,附子药物血清中含有乌头碱、新乌头碱和次乌头碱,稀释102倍的含药血清及更高浓度可延长动作电位时程和超射值,且其作用随体外给药的时间延长作用更明显。3新乌头碱对心肌动作电位及心肌细胞内钙的影响目的:观察新乌头碱对豚鼠乳头肌动作电位的影响,并从心肌细胞内钙和hERG电流的角度对其可能的作用机制进行分析。方法:(1)用标准玻璃微电极技术记录豚鼠乳头肌的动作电位,在1Hz的刺激频率下,MA在10-10、10-9、10-8及3×10-8mol/L终浓度时,观察给药前后AP的变化。(2)观察不同刺激频率下(0.3Hz,1Hz和3Hz)3×10-8mol/L浓度时,给药前后APD90的变化及计算其变化百分率。(3)酶解法分离豚鼠心室肌细胞,负载Fluo4-AM,激光共聚焦技术检测细胞内Ca2+离子浓度([Ca2+i)的荧光强度(FI),结果以给药前后相对荧光密度(FI -FI0)/FI0×100表示。给予不同浓度的新乌头碱,观察新乌头碱对心室肌肌[Ca2+]i的影响。(4)在稳态表达hERG通道的HEK293细胞株上,用全细胞膜片钳技术记录hERG电流,观察高浓度(10-5)MA对hERG电流的影响。结果:(1)在1.0Hz刺激频率下,10-10、10-9 mol/L的MA对AP各参数无明显影响。当浓度增大至10-8 mol/L时,APD90由给药前190.6±4.6ms缩短至177.2±6.9ms,此变化有统计学意义(p<0.05)。并且随MA浓度增加,动作电位时程进一步缩短,振幅变小,3×10(-80mol/L时出现自发性动作电位,APD50及APD90缩短更加明显(p<0.05),APD90 由给药前190.6±4.6ms缩短至166±4.7ms,但是APD90-30反而延长(p<0.05)。(2)0.3、1、3Hz不同频率刺激时,3×10-8mol/L MA延长APD90-30作用呈现反向频率依赖性。(3)10-10、10-9、10-8mol/L的MA可浓度依赖性升高[Ca2+]i,在含钙台式液中,胞内钙荧光强度可分别升高24.3%,54.8%,129.2%,无钙台式液中升高18.6%、49.5%、91.5%。在含钙和无钙台式液中Ryanodine(10-5mol/L)抑制了MA(10-90mol/L升高胞内钙的作用,荧光强度分别由53.0%、41.5%下降至45.3%和13.5%。(4)MA (10-5mol/L)对hERG电流无明显影响。结论:MA影响APD,诱发乳头肌出现自发性动作电位,主要原因与升高心室肌[Ca2+]i有关,而与hERG通道无关。MA延长APD90-30作用与附子药物血清作用相同,不同的是APD90和APD30表现不一样,其原因有待进一步分析。总结:附子所含的新乌头碱通过调节钙通道活性而非hERG通道相对延长了APD90-30,是引起大鼠心律失常,尤其是QT间期延长的原因之一。