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目的:全球范围内乳腺癌的发病率及死亡率均居于女性恶性肿瘤首位,年新发病例约170万(占年女性癌症新发病例的25%),是女性中最常见的癌症,近年来,乳腺癌发病率及死亡率均呈明显上升趋势,并出现年轻化趋势,严重危害女性生命安全。mir-210位于人类基因组编码位点(chr11:568089-568198),与缺氧途径紧密相关,是一种经典的缺氧反应性micro RNA,癌细胞维持在缺氧状态下仍能快速增殖,mir-210在缺氧细胞中常明显上调,在乳腺癌细胞分化中起重要作用,并参与乳腺癌肿瘤的增殖、侵袭、转移及不良预后的产生等,因此,通过探索mir-210在乳腺癌细胞中上调表达及相关机制,有望在乳腺癌的治疗、疗效评估及预后预测等取得一定的成果。本实验通过对mir-210在乳腺癌中表达水平变化对下游基因蛋白表达的影响及其关联性研究,探讨mir-210表达对乳腺癌细胞控制通路的下游基因可能产生的影响,以期进一步探讨mir-210对乳腺癌细胞增殖、迁徙与侵袭等可能存在的干预机制,为后续基础及临床研究提供思路和参考。方法:(1)筛选在乳腺癌中异常表达并具有统计学意义的micro RNA。利用Perl(http://www.perl.org/)软件和R(https://www.r-project.org/)软件对TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)数据库中的乳腺癌数据进行筛选,检出在TCGA数据库乳腺癌样本中差异表达并具有统计学意义的micro RNA。通过在线下载乳腺癌高通量测序-micro RNA表达谱数据,获得乳腺癌样本的micro RNA表达谱数据。(2)通过pubmed数据库筛选由其他研究证实与目标micro RNA相拮抗的下游基因,通过The Human Protein Atlas(https://www.proteinatlas.org/)查找高表达该基因的细胞系用作Western blot实验的阳性参照。(3)实验选用来自细胞库液氮保存的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株,经细胞复苏、贴壁培养、传代,制备均匀细胞悬液,计数、稀释完毕,进行分组。(4)通过阳离子脂质体法(Lipofection)将候选micro RNA瞬时转染至目标乳腺癌细胞株,并用Real-time q PCR检测转染效果。Trizol试剂提取RNA细胞株,TOYOBO逆转录试剂盒对收集的RNA进行逆转录,逆转录使所用的micro RNA上下游引物为茎环法(Stem-Loop Method)设计的基因特异性引物,选用U6作为内参,再用q PCR反应体系进行扩增,扩增用引物,PCR仪荧光定量测定。(5)采用RIPA裂解液试剂提取总蛋白,酶联免疫检测仪(Microplate Reader)分析计算待测样品蛋白浓度。(6)取出待测样本,采用Western-blot技术,上样、转膜、anti-MNT及anti-GAPDH等,暗室内采用增强化学发光法(Enhanced Chemiluminecence,ECL)对反应底物进行胶片显影、定影及凝胶成像扫描。检测验转染后乳腺癌细胞株内候选micro RNA转录水平及其下游基因蛋白的表达水平,通过对比,检验乳腺癌细胞株中候选micro RNA水平及其对下游基因表达水平是否改变。(7)通过基于c DNA测序的基因表达谱对比,分析转染后乳腺癌细胞株内差异表达的基因。结果:(1)经过R软件分析,从TCGA的1103例乳腺癌组织micro RNA表达谱样本中筛选出差异表达有统计学意义的micro RNA共393个,其中高表达301个,低表达92个。(2)mir-210位列高表达组第13位,FDR(False Discovery Rate)为2.81E-51,log FC(log2Fold Change)约为3.2176,有统计学意义。通过mir Base Tracker(http://www.mirbasetracker.org/)网站追溯mir Base(http://www.mirbase.org)数据库信息,将mir-210基因名更新为mir-210-3p,并从中选出mir-210下游基因MNT,通过The Human Protein Atlas网站筛选出MNT高表达的Hela细胞株作为阳性参照组。(3)MDA-MB-231乳腺癌细胞及Hela细胞生长状况良好,细胞株复苏后快速进入细胞生长对数期,传代或冻存周期约为间隔1日。提取各组样本总RNA,浓度均大于1.5μg/μl,A260/280值均1.8~2.0。经Real-time q PCR检测,与对照组相比,mir-210-3p Inhibitors转染组及mir-210-3p Inhibitors Negative Control转染组的细胞中mir-210-3p的表达水平均降低,Inhibitors组mir-210-3p的表达水平降至对照组的0.037倍。(4)提取转染后培养48小时的对照组、mir-210-3p Inhibitors Negative Control转染组和mir-210-3p Inhibitors转染组的MDA-MB-231乳腺癌细胞总蛋白,经过考马斯亮蓝染色法(Coomassie Blue Staining,CBS)染色后,酶联免疫检测仪(Microplate Reader)测得样品浓度分别为:5.286/5.479/3.645μg/μl。阳性参照组Hela细胞总蛋白样品测得浓度为7.184μg/μl。各个样品定量取40μg总蛋白,用Western-blot检测MNT蛋白表达水平,对照组MNT蛋白低表达,mir-210-3p Inhibitors Negative Control转染组以及mir-210-3p Inhibitors转染组中MNT蛋白表达水平均出现提高,Inhibitors组较另外两组更为明显,与Real-time q PCR结果相符。(5)送测序RNA样品编号1(对照组)、编号2(Inhibitors转染组)定量与纯度A260/A280分别为1.9和1.92,A260/A230分别为2.34和2.15。RIN值分别为10.50和9.90,质量检测结果通过,样本完整性良好可用于芯片实验。(6)通过c DNA芯片表达谱对比,共筛选出差异表达基因316个,其中上调基因数176个,下调基因数140个。(7)KEGG的信号通路富集分析:在转染mir-210-3p Inhibitors后的MDA-MB-231乳腺癌细胞株中,差异表达基因主要在致癌错误转录(Transcriptional misregulation in cancer)、MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)信号传导通路和趋化因子信号通路(Chemokine Signaling Pathway)信号通路中出现富集(Enrichment)。(8)Gene Ontology(GO)富集分析:差异表达基因影响趋化因子活性、转录因子结合、转录调节区DNA结合、转录激活物活性及RNA聚合酶II(RNA Polymerase II)核心启动子近端区域序列的特异性结合,差异基因产物多位于核染色质,质膜,质膜组件,膜的锚定组分(Anchored Component Of Membrane),CHOP-ATF3复合物及蛋白复合物。结论:(1)通过生物信息学分析获取mir-210在乳腺癌中总体呈现高表达;(2)通过基因表达谱分析,成功筛选出乳腺癌细胞中受mir-210表达水平改变影响的差异基因共316个;(3)经富集分析,显示差异表达基因相关信号通路有趋化因子信号通路、MAPK信号传导通路、致癌错误转录通路;差异基因产物多位于核染色质,质膜,质膜组件,膜的锚定组件,CHOP-ATF3复合物,蛋白复合物;(4)mir-210-3p水平改变影响乳腺癌细胞多信号通路及下游基因蛋白表达水平。