牛属于单胎动物,在牛的一个发情周期中,卵巢内一般只有一个卵泡会发育成熟并排卵,而卵巢上大量参与发育的卵泡则在其生长过程中就闭锁凋亡。排卵率低一直是限制牛,羊等单胎动物大规模繁育的关键因素。本课题组前期以母牛为研究对象,利用高通量深度测序技术筛选出10个与牛发情周期卵泡发育相关的基因,确定丝氨酸蛋白酶35(serine protease 35,PRSS35)与牛卵泡的发育相关。本试验以山西省文水县肉牛屠宰场海福特牛卵巢作为研究对象,首先扩增牛卵巢PRSS35基因CDS序列并进行生物信息学分析;接着筛选出牛优势卵泡与从属卵泡;对PRSS35蛋白在牛卵泡颗粒细胞中进行定位,接着从基因与蛋白两方面研究PRSS35对牛卵泡颗粒细胞的影响;最后通过基因沉默,siRNA转染颗粒细胞确定PRSS35基因在牛卵泡颗粒细胞生长发育中的作用,为探究PRSS35对牛卵泡发育过程中的作用奠定理论与实践基础。本试验的研究结果及结论如下:1.牛PRSS35基因CDS区序列全长1239 bp,编码412个氨基酸。其蛋白PRSS35等电点9.82,碱性蛋白,分子量46.5KDa,是一种不稳定亲水性分泌蛋白,具有长度为20个氨基酸的信号肽,11个O-糖基化位点、2个N-糖基化位点和3个磷酸化位点,有一个典型Tryp_Spc结构域,即胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域。进化分析表明,牛与同为牛亚科水牛、以及牛科绵羊、山羊亲缘关系最近,与啮齿目大鼠和小鼠亲缘关系最远。2.对12头牛卵巢最大卵泡与第二大卵泡卵泡液进行ELISA激素测定,三头牛最大卵泡E2浓度显著高于第二大卵泡(P<0.05),最大卵泡P4浓度显著低于第二大卵泡(P<0.05)。12头牛共筛选出3头牛的最大卵泡和第二大卵泡分别为牛优势卵泡和从属卵泡。3.免疫组化分析表明,PRSS35在牛优势与从属卵泡颗粒层均有表达;荧光定量PCR结果显示PRSS35mRNA在牛优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著高于从属卵泡(P<0.001);Western Blot结果显示PRSS35蛋白在牛优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著高于从属卵泡(P<0.01)。4.基因沉默结果表明,沉默PRSS35基因会使卵泡颗粒细胞凋亡个数增多,卵泡液雌激素含量降低,说明PRSS35基因促进牛卵泡颗粒细胞的增殖,对牛卵泡生长发育起促进作用。