中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）是中国近海特有种，主要分布于我国黄渤海和朝鲜西部沿海，是我国最具经济价值和营养价值的海产品之一。对虾的血淋巴承担着许多重要的生理机能，是内环境中重要的组成部分，通过消化吸收的营养物质和体内分泌的激素等，大多通过血淋巴运输到各组织细胞中，维持机体的基础代谢和生长发育。对虾的血淋巴是中间代谢的场所，其蛋白质的变化将有效揭示对虾生理和病理的变化机制。因此，要对复杂的生命活动有全面的认识，必然要在蛋白质水平上对生物体进行深入的研究。对虾血淋巴蛋白质组学作为功能基因组研究的重要内容之一，目前处于刚起步阶段，国内外报道不多。本论文是围绕当前血淋巴蛋白质组学研究中存在的问题开展工作的，首先对中国明对虾血淋巴中的2种最主要的高丰度蛋白（血蓝蛋白、凝血蛋白）进行了研究，以了解中国明对虾高丰度蛋白的性质以及在血淋巴中的组成与存在形式；在此基础上，建立起一套适合对虾血浆蛋白组分析的双向电泳技术，应用多种方法建立与评估了血浆高丰度蛋白的去除技术，为甲壳动物血淋巴蛋白质组研究提供了可靠的技术手段；进一步应用差异蛋白质组学的方法基于两种策略（2-DE、ClinProt）研究分析了对虾血淋巴在LPS免疫诱导下早期蛋白质表达的变化，筛选出一批与早期免疫防御相关的蛋白与多肽，在研究血淋巴蛋白质组学新方法的建立方面进行了有益的探索和研究。主要包括以下内容：一、中国明对虾血淋巴主要高丰度蛋白的研究应用超速离心、凝胶过滤层析与离子交换层析对中国明对虾血淋巴中不同多聚体的血蓝蛋白进行了分离纯化，得到了六聚体（450kDa）与十二聚体（900kDa）血蓝蛋白，研究发现，六聚体血蓝蛋白由3个亚基组成，十二聚体血蓝蛋白由4个亚基组成，其亚基分子量均约为75kDa，它们含有3个共同的亚基，十二聚体含有一特有亚基；通过对血淋巴中血蓝蛋白的多聚体存在形式分析，发现血蓝蛋白在天然血淋巴中主要以六聚体和十二聚体形式存在，六聚体存在形式非常稳定，而十二聚体在强碱、去除Ca2+以或添加还原剂等情况下会发生解离，各种形式的血蓝蛋白多聚体是对虾血淋巴中最主要的高丰度蛋白；将纯化的血蓝蛋白用于制备多克隆抗体，ELISA方法检测抗体效价高，蛋白印迹检测对虾血淋巴获得特异性条带与预期大小一致，可用于进一步科学研究。通过联合应用离子交换层析与疏水作用层析从中国明对虾的血淋巴中分离纯化出凝血蛋白（CP）。该CP在体外凝血实验中有HLS和Ca2+存在的情况下可以形成血凝块，从而揭示了中国明对虾的凝血反应也是由Ca2+依赖性的转谷氨酰胺酶所催化。经SDS-PAGE分析纯化的CP约为380kDa，其亚基的分子量约为190kDa，说明该蛋白是由两个相同的亚基组成的同源二聚体。N末端氨基酸序列分析表明，中国明对虾CP的N末端序列与凡纳滨对虾、保罗美对虾具有100%的相似性，与其他对虾的比对也具有66%至80%的较高相似性。利用同源克隆技术获得了CP基因518bp的cDNA片段，分析表明该基因序列与其他虾类CP基因序列的具有很高的同源性。通过RT-PCR对CP基因的组织表达谱进行了分析，发现心脏和表皮是该基因主要的合成表达部位。二、中国明对虾血淋巴双向电泳蛋白质组学平台的优化与建立本论文提出了中国明对虾血淋巴采集的标准化方式，中国明对虾的血淋巴经脱盐处理后，通过固相pH梯度胶条等电聚焦、SDS-PAGE垂直电泳对蛋白质进行分离，对不同pH范围IPG胶条、脱盐方式、上样方式、上样量等进行了优化，并分别利用硝酸银和胶体考染方法进行染色，应用PDQuest软件对图谱进行了初步分析，采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对主要的高丰度蛋白点进行了质谱鉴定。结果显示中国明对虾血淋巴在pH4～7范围、18cm的2-DE胶上得到了很好的分离，上样量为150μg左右，采用银染可以获得较好的分析胶图谱；而上样1000μg左右，采用胶体考染方法能获得较好的制备胶图谱；通过MALDI-TOF/TOF MS鉴定的11个最主要的高丰度蛋白点都是血蓝蛋白。本研究建立并优化了中国明对虾血淋巴蛋白质组学的双向电泳技术体系，为进一步开展对虾等甲壳动物的血淋巴蛋白质组学研究奠定了基础。应用超速离心技术、固定化金属亲和层析技术、PEG分级沉淀技术去除中国明对虾血淋巴高丰度蛋白—血蓝蛋白，首先进行了各种技术关键参数的筛选，制备了去除高丰度蛋白后的样品，进一步比较了去除前后对虾血淋巴2-DE图谱的差异以判断去除的效果，结果显示超速离心技术可有效去除对虾血淋巴高丰度蛋白（血蓝蛋白），提高低丰度蛋白的检出敏感性，初步解决了分析样品中的高丰度蛋白是影响蛋白质表达谱分析的重要障碍和技术瓶颈，为甲壳动物血淋巴蛋白质组研究提供了可靠的技术手段。三、基于两种策略的中国明对虾免疫诱导的血淋巴差异蛋白质组（多肽组）学研究运用2-DE差异蛋白质组学的方法分析了LPS免疫诱导后早期对虾血淋巴中蛋白质表达水平的变化。用LPS免疫刺激对虾后，用双向凝胶电泳的方法来检测血淋巴中蛋白质的表达。在双向电泳图谱上的300多蛋白点中检测到5个蛋白质斑点在免疫诱导后上调，10个蛋白质斑点在免疫诱导后下调。利用MALDI-TOF MS对15个差异表达的蛋白质进行了鉴定，其中有6个为血蓝蛋白，上述结果表明，在免疫诱导的急性期血蓝蛋白可能以多种形式参与了对虾的急性感染期的免疫反应，是一种非常重要的免疫功能蛋白。本项目采用先进液体芯片飞行时间质谱技术（ClinProt系统）对不同采集方式的中国明对虾血淋巴样品进行了分析，初步建立起一套稳定的中国明对虾血清多肽组学分析的研究方法，并对注射LPS诱导的急性时相反应的血清多肽谱的变化进行了质谱分析，共检测到103个蛋白峰，蛋白范围集中于1000～10000Da，利用FlexAnalysis3.0和ClinProTools等相关支持软件筛选出对照组与注射LPS组组间有13个差异表达蛋白（多肽）且都是在免疫诱导呈后低表达(p<0.05)，通过遗传算法（GA）建模得出免疫诱导组的诊断组合模式，其诊断灵敏度为100%，特异性为100%。为从血淋巴中筛选出具有早期免疫防御功能的标志蛋白或多肽，从而进一步为对虾等甲壳动物的免疫反应机理研究奠定了基础。上述研究为了解中国明对虾独特的免疫防御机制提供了理论依据与新的技术手段，使我们对甲壳动物的天然免疫反应有了进一步的认识，同时也为今后开展大规模的中国明对虾血淋巴蛋白质组学研究工作奠定了良好的基础。