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甘油脱水酶(glyceroldehydratase,EC4.2.1.30)能催化甘油和1,2-丙二醇转化为相应的醛。近来,由于其作为由生物转化法生产1,3-丙二醇(工业上有重要用途的化工材料)的限速酶而成为研究热点。现在已发现的甘油脱水酶存在于代谢产物含有1,3-丙二醇细菌中,如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、弗氏柠檬菌(Citrobacterfreundii)和梭菌属巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)等。不同来源甘油脱水酶在蛋白质一级结构上都具有较高的保守性。
通过对甘油脱水酶氨基酸序列的Blast分析,我们发现产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)基因组序列的一个多顺反子中存在五个开放读码框,它的氨基酸序列与其它甘油脱水酶及其激活因子的氨基酸序列同源性较高。但在GenBank上这些读码框有些被注释为甘油脱氢酶,有些并未进行注释。为鉴定这些读码框的功能本研究以产气荚膜梭菌的总DNA为模板,PCR扩增假定的甘油脱水酶基因和甘油脱水酶的激活因子,分别构建表达质粒pET-dhaBCE和pSE-dhaFG,并在大肠杆菌中表达。经SDS-PAGE分析结果显示重组菌pET-dhaBCE和pSE-dhaFG分别有61kD、21kD、16kD和66KD、13KD特异性蛋白条带出现。利用金属镍亲和层析及S-300H凝胶层析将重组蛋白进行分离纯化,得纯蛋白dhaBCE和dhaFG。重组蛋白dhaBCE具有甘油脱水酶活性,以甘油和1,2-丙二醇作底物,比活分别为131U/mg和87U/mg。此甘油脱水酶的最适反应温度约为42℃,最适作用pH约为9.2,其对甘油、1,2-丙二醇和乙二醇的Km值分别是0.30mM、0.48mM和3.90mM,对酶催化活性必需的辅酶B12的Km值为8.2nM。重组蛋白dhaFG能够把经氧完全失活的甘油脱水酶重新激活,并能维持甘油脱水酶在以甘油为底物进行催化时的活性。
本研究对产气荚膜梭菌的甘油脱水酶及其激活因子进行了初步鉴定。这为了解1,3-丙二醇的代谢合成途径和探索新的微生物发酵生产1,3-丙二醇提供了理论依据。