米曲霉是酿造传统酱油和酒类的GRAS级别的安全菌株,已有一千多年的应用历史。虽然米曲霉的基因组测序于2005完成,但有很多重要功能基因还有待于进一步的诠释和挖掘。氧化甾醇结合蛋白是一类存在于真核生物体内结合氧化甾醇的保守蛋白。它具有参与细胞中脂类代谢、囊泡运输及信号传导等方面的重要功能。更重要的是大量研究表明这类蛋白具有能够结合氧化甾醇及植物甾醇的功能,这也是我们要研究氧化甾醇结合蛋白基因(osbp)的重要原因之一。本研究以来源于米曲霉3.042的氧化甾醇结合蛋白为研究对象,主要进行了以下方面研究:1生物信息学分析结果表明米曲霉氧化甾醇结合蛋白(AoOSBP)是一个典型保守型蛋白,而且它的功能域之一的配体结合域也是相当保守的,并包含被称之为指纹序列的,可用于查找氧化甾醇结合蛋白的同系物。在进化上该基因与黄曲霉的氧化甾醇结合蛋白基因具有99%的相似度。2运用了qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法这三种基因的表达模式,对不同生长时间米曲霉菌丝体中氧化甾醇结合蛋白从基因水平到表达水平进行了定性定量的分析。由qRT-PCR的实验结果表明,在24 h,36 h,48 h,60 h,72 h这五个时间点的时候,AoOSBP的基因表达水平没有明显的变化,只是相比较于24 h时,72 h的基因表达量有所增加。Western blot实验结果显示,在不同生长时间点时,AoOSBP的表达量在48 h和60 h会稍有增加。但是整体而言蛋白表达量的增加不明显。通过免疫荧光实验可以粗略的看出,不同生长时间点氧化甾醇结合蛋白移动去向。在24 h时,AoOSBP主要集中在细胞核中,进而到36 h和48 h时,开始有孢子生成,可以看到该蛋白分布到整个菌丝体及新产生的孢子中。到60 h和72 h时,孢子已经成熟,只能观察到菌丝体中该蛋白还是有很高的表达量。由以上结果可以看出,氧化甾醇结合蛋白在米曲霉生长的不同时期都具有高的表达量。3构建了两种表达载体pET-30a-osbp和pMAL-c4X-osbp-ord,分别表达了AoOSBP和米曲霉氧化甾醇结合蛋白的配体结合域蛋白(AoOSBP-ORD)。相同的诱导条件下,通过SDS-PAGE分析,pET-30a-osbp载体表达的AoOSBP在诱导前后的表达量没有明显的增加,但是由Western blot检测得出全长蛋白是有表达的。然而,pMAL-c4X-osbp-ord载体表达的AoOSBP-ORD在诱导后表达量有明显的增加,并且通过直连淀粉酶柱纯化得到了较纯净的AoOSBP-ORD。4运用新型微量热泳动技术对原核表达重组蛋白AoOSBP和AoOSBP-ORD的功能进行了分析。AoOSBP的结合实验结果表明,它具有结合麦角甾醇(Kd=74.338 nM)、25-羟基胆固醇(Kd=29.899 nM)、7-酮胆固醇(Kd=7.772 nM)、大豆甾醇(Kd=24.717 nM)、豆甾醇(Kd=32.469 nM)、菜油甾醇(Kd=20.328 uM)和β-谷甾醇(Kd=27.521 uM)的能力。因为Kd值越小说明蛋白与底物的结合能力越强,由结合它们的Kd值可以看出,该蛋白对除菜油甾醇和β-谷甾醇的底物都有很强的结合能力。然而,当我们用AoOSBP-ORD对全长蛋白的以上功能进行验证的时候,AoOSBP-ORD对以上七种甾醇底物中的菜油甾醇和β-谷甾醇没有结合能力,对其他几种甾醇底物具有较强的结合能力。因此,AoOSBP可以充当甾醇运输的一个载体,并且氧化甾醇和植物甾醇对降低胆固醇有一定的作用,米曲霉氧化甾醇结合蛋白在开发降低胆固醇的食品和药物中也具有重要的应用价值。