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背景和目的越来越多的流行病学调查表明,慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)是威胁全球公共健康的主要疾病之一。本课题组前期研究结果显示,郑州市20岁以上成年人CKD标化患病率为11.51%。从病理进展的角度来讲,无论其病因为高血压、糖尿病或者慢性肾炎,CKD进展至终末期肾脏病时,病理类型主要表现为肾小球硬化和肾小管间质纤维化。目前很多研究关于人类肾脏疾病或者动物实验中发现,肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS)在肾脏疾病的发生发展中起着至关重要的作用。肾素-血管紧张素系统的过度兴奋不仅仅表现为通过血液动力学的改变促使血压上升,加速残肾单位的肾小球硬化,而且血管紧张素II (AngiotensinⅡ,AngⅡ)还通过一些非血液动力学的作用直接或间接地参与了肾小球硬化的发生与发展。RAS抑制剂——血管紧张素受体拮抗剂(Angiotensin receptor antagonist, ARB)的临床应用成为抑制肾小球硬化、延缓CKD进展的有效方法之一。本课题组Fogo等前期进行的动物体内实验研究提出大剂量RAS抑制剂可通过降低纤溶酶原激活物抑制物-1(Plasminogenactivator inhibitor-1, PAI-1)的表达从而逆转肾小球硬化。而PAI-1除了具有抑制细胞外基质分解促进合成的作用,同时PAI-1也在足细胞中表达,可以直接调节足细胞分化和细胞骨架重构。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,足细胞损伤必将导致蛋白尿的出现并促进肾小球硬化。肾小球硬化与细胞外基质的增多积聚密不可分,Ⅳ型胶原作为细胞外基质和基底膜的主要成分,其合成和分泌增多是导致肾小球硬化的主要参与因素之一。目前足细胞损伤及修复是肾脏病学研究的热点,最新研究显示壁层上皮细胞具有转分化为足细胞的潜能,进而修复损伤的足细胞。然而,长期应用ARB是否可以更多地保护足细胞、逆转肾小球硬化、改善长期生存率,目前尚缺乏与此相关的报道。因此,本研究拟采用5/6肾切除大鼠模型,观察长期应用ARB(氯沙坦)对CKD大鼠生存率的改善及其对足细胞的保护作用,并通过体外原代培养足细胞,观察血管紧张素Ⅱ诱导足细胞凋亡情况和氯沙坦对受损足细胞分泌Ⅳ型胶原的影响,深入探讨了ARB对足细胞损伤保护作用及可能机制,为临床长期应用ARB延缓CKD进展、改善CKD生存率提供可能的实验依据。本研究共分两个部分：体内实验：观察长期应用氯沙坦改善5/6肾切除CKD大鼠生存率及其对足细胞损伤的修复作用建立5/6肾切除CKD大鼠模型并于8周末通过开放肾活检证实肾小球硬化,观察长期应用氯沙坦对大鼠30周生存率的改善作用和肾组织PAI-1的表达,并探讨氯沙坦对足细胞的保护作用及其机制。体外实验：探讨氯沙坦对血管紧张素Ⅱ刺激足细胞损伤的保护作用及其机制体外原代培养WT和PAI-1-/-小鼠足细胞,分别给予血管紧张素Ⅱ刺激,观察足细胞凋亡情况,进一步证实血管紧张素Ⅱ促进PAI-1分泌诱导足细胞凋亡；在此基础上给予氯沙坦干预,观察血管紧张素Ⅱ对足细胞分泌Ⅳ型胶原的情况及氯沙坦对受损足细胞分泌Ⅳ型胶原的影响,深入探讨了氯沙坦对足细胞的保护作用及机制。第一部分：体内实验长期应用氯沙坦改善5/6肾切除CKD大鼠生存率及对足细胞损伤的修复作用一、材料与方法雄性SD大鼠50只,250～300克。建立5/6肾切除CKD大鼠模型并于8周末通过开放肾活检PAS染色证实肾小球硬化,经历两次手术后存活大鼠41只,按照肾小球硬化指数(Sclerosis Index, SI)、血压、24小时尿蛋白定量匹配后分为两组：对照组(CONT,n=21),ARB组(ARB,氯沙坦200mg/L溶于饮用水中,n=20),两组SI、血压、24小时尿蛋白定量平均值相当。于0、8、16、24及30周分别测量体重、血压、24小时尿蛋白定量和血肌酐；观察大鼠存活情况至30周,于濒死前或30周末处死大鼠留取肾组织,行PAS染色观察肾小球硬化程度的变化,行Western blot观察肾组织PAI-1的表达,行免疫组织化学方法WT-1染色(足细胞标记)和免疫荧光双染法Claudin1(壁层上皮细胞标记)和Synaptopodin(足细胞标记)染色检测肾小球内足细胞损害/修复及壁层上皮细胞-足细胞转化。用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析(用log-rank法进行显著性检验),并绘制生存曲线。将单因素分析对生存率有统计学意义的因素再纳入多因素Cox回归分析模型进行分析,运用ROC曲线评价硬化指数在生存评判中的价值,并找出适宜的临界点值。所得结果选取α=0.05作为差异具有统计学意义的检验水准。二、结果1.两组大鼠8周时血压、24小时尿蛋白定量均升高,差异无统计学意义(P>0.05),16、24周时ARB组血压、24小时尿蛋白定量均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。24、30周ARB组血肌酐均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.ARB组大鼠30周生存率明显高于对照组,差异有统计学意义(中位生存时间27.1周vs19.7周,ARB vs CONT, P=0.0056)。单因素生存分析结果显示肾活检时硬化指数(P=0.0057)、蛋白尿(P=0.0113)、是否给予ARB干预(P=0.0128)是影响生存率的重要因素。根据多因素Cox回归分析模型得到,在其他因子水平固定的情况下,对照组的死亡风险是ARB组的3.5倍(P=0.0019),肾活检即给予干预时硬化指数每增加一个单位,死亡风险增加2.9倍(P=0.0006)。肾活检硬化指数的ROC曲线下面积(AUC)为0.65,最佳Cut-off值取1.1,即对于慢性肾脏病大鼠,应于早期进行干预以延长生存时间。根据Cut-off值对大鼠分成亚组,ARB对硬化指数不同的大鼠生存率均有改善(SI≤1.1大鼠,中位生存时间>30周vs20.6周,ARB vs CONT,P=-0.0284；SI>1.1大鼠,中位生存时间22周vs17.3周,ARB vs CONT, P=0.0153)。3.ARB组大鼠终点时间点平均硬化指数和每周硬化指数进展率均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.ARB组大鼠终点时间点PAI-1表达低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.肾活检时各组肾小球内足细胞较正常大鼠减少,壁层上皮细胞数目较正常大鼠明显增多,终点时间时ARB组肾小球内足细胞数目及壁层上皮细胞的表达均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；免疫荧光双染显示ARB组存在更多壁层上皮细胞标记Claudin-1和足细胞标记Synaptopodin双阳性情况,提示ARB可能促进壁层上皮细胞-足细胞转分化修复足细胞损伤。第二部分：体外实验氯沙坦对血管紧张素Ⅱ刺激足细胞损伤的保护作用及机制探讨一、材料与方法原代培养野生型和PAI-1-/-小鼠足细胞,行WT-1、nephrin和Synaptopodin染色鉴定。将野生型和PAI-1-/-小鼠足细胞分别分为两组：对照组、AngⅡ (10-7M,24h),检测细胞上清中PAI-1的活性及PAI-1缺失对AngⅡ所致足细胞凋亡的保护作用。为观察ARB对AngⅡ刺激足细胞分泌Ⅳ型胶原的影响及PAI-1在其中发挥的作用,我们将野生型和PAI-1-/-小鼠足细胞分别分为三组：对照组、AngⅡ (10-7M,48h)组和AngⅡ (10-7M,48h)+ARB (10-5M,72h)组,ELISA法检测细胞上清中Ⅳ型胶原表达量。二、结果1.足细胞的鉴定。免疫荧光染色鉴定3个表达分化成熟的足细胞标志性抗原WT-1、nephrin和synaptopodin,证实该细胞为纯化的足细胞。2. AngⅡ刺激野生型小鼠足细胞分泌PAI-1增多,AngⅡ使野生型足细胞凋亡增加90.91%,给予AngⅡ刺激后,野生型小鼠足细胞抑制凋亡蛋白Bcl-xL表达较对照组显著下降(P<0.05)；而AngⅡ对PAI-1-/-小鼠足细胞的刺激分泌PAI-1和凋亡影响不大,对Bcl-xL表达量也并无影响(P>0.05)。3. ELISA结果显示,与对照组相比,AngⅡ可明显诱导野生型小鼠足细胞Ⅳ型胶原分泌增多(P<0.05),给予ARB后可几乎完全阻断AngⅡ的这种诱导作用；而与野生型足细胞相比,PAI-1缺失可减少Ang II诱导足细胞IV型胶原的分泌(P<0.05)。结论1.氯沙坦可改善5/6肾切除大鼠30周生存率,肾小球硬化程度较低的大鼠生存时间较长。2.氯沙坦可降低5/6肾切除大鼠血压、蛋白尿,改善肾功能,延缓肾小球硬化进展。3.氯沙坦对肾脏的保护作用可能是通过降低PAI-1表达介导的。4.壁层上皮细胞-足细胞转分化可能参与了损伤足细胞的修复,氯沙坦可能促进该转分化过程延缓CKD进展。5.PAI-1缺失可改善血管紧张素Ⅱ所致足细胞凋亡。6.氯沙坦可阻断血管紧张素Ⅱ诱导足细胞的Ⅳ型胶原分泌,PAI-1缺失可减少Ang II诱导足细胞Ⅳ型胶原的分泌。