肾肿瘤是泌尿生殖系统常见的肿瘤,其治疗手段以手术为主,放化疗、免疫治疗、血管栓塞及各种能量消融等辅助治疗手段主要用于晚期肾肿瘤,但均不能取得满意疗效。近年来,大量临床实验显示靶向药物疗效优于传统治疗方法,索拉菲尼便是其中之一,使多数患者受益。然而,仍有部分患者肿瘤进展得不到有效控制,其原因可能与肿瘤细胞对靶向药物耐药有关。产生耐药的机制复杂,其中肿瘤细胞自噬与此密切相关,而Akt信号通路是调节肿瘤细胞自噬关键通路之一。因此本文围绕索拉菲尼治疗晚期肾肿瘤临床疗效评价及部分患者肿瘤进展原因展开研究,探讨自噬及Akt信号通路在其中的作用机制,并将论文分为三部分:第一部分,评价索拉非尼治疗晚期肾癌的疗效及不良反应,大多数患者肿瘤得到控制,但仍有少部分患者肿瘤进展,这与瘤细胞对索拉菲尼敏感性降低有关;第二部分,通过调节自噬水平,增敏肾癌索拉菲尼治疗敏感性,探讨通过乌苯美司逆转瘤细胞索拉菲尼耐药的可行性,恢复索拉菲尼对瘤细胞疗效;第三部分,探讨Akt信号通路在乌苯美司增强索拉菲尼敏感性及抑制肾癌细胞侵袭性中的作用。由此可以明确乌苯美司通过抑制Akt信号通路调节自噬,逆转瘤细胞索拉菲尼耐药,恢复索拉菲尼敏感性,Akt信号通路在其中起关键作用,并且乌苯美司通过抑制Akt信号通路可以抑制肾癌细胞侵袭性,提示索拉菲尼联合乌苯美司可能是一种治疗晚期肾癌的新策略,并取得更优疗效,单用索拉菲尼治疗后肿瘤仍进展的患者可能因此受益,但这需要后期的临床实验证实。第一部分索拉非尼治疗晚期肾癌的疗效及不良反应背景肾癌是临床上最常见的泌尿系肿瘤之一,占成人恶性肿瘤的4%,占成人肾恶性肿瘤的80-90%。在中国,肾癌影响45.3万人,每年造成39.6万人死亡。发达国家的发病率高于发展中国家,男性的发病率高于女性。导致肾癌的主要因素包括吸烟、酗酒和肥胖。肾癌早期无明显症状,患者出现血尿、疼痛、肿块的症状多提示晚期,并且发生了肿瘤转移。目前,外科治疗仍是肾癌的主要治疗方法。然而,32%的肾癌患者术后仍会发生复发和转移。晚期患者生存期6-12个月,5年生存率<10%。传统的治疗方法如放疗、化疗和干扰素仅对10-30%的患者有效。近年来,大量临床开放性三期试验表明,靶向药物治疗晚期肾癌优于放射化疗和干扰素,耐受性好,不良反应小。癌症治疗已进入靶向治疗的时代。索拉非尼作为一种激酶抑制剂,抑制多种细胞外和细胞内激酶,具有双重抗肿瘤和抗血管生成作用。它能抑制MRK和RAF信号通路以及VECFR、PDGFR和肿瘤新生血管,已成为治疗晚期肾癌的一线靶向药物。本研究分析了山东大学(中国,济南)附属山东省立医院索拉非尼治疗晚期肾癌的临床资料,并对其疗效、副作用及预后进行了分析,为晚期肾癌的治疗提供了参考。目的本研究目的在于评价索拉非尼治疗晚期肾癌的疗效和安全性。方法观察组包括从2010年1月至2013年8月应用索拉非尼+干扰素治疗的74例晚期肾癌患者。另外53名仅用干扰素治疗的病例作为对照组。我们把这些病例的临床一手资料收集集中,然后进行回顾性分析。治疗方案:索拉非尼初始剂量为400毫克,每天两次。所有患者每隔一天用300MU干扰素治疗。根据Recist标准记录无进展生存率(PFS)、总生存率(OS)和不良反应发生率来评估疗效。结果观察组中,总生存时间中位数为15.3个月(范围,9-60个月),无进展生存时间中位数为8.2个月(范围,2-36个月)。完全缓解(CR)的患者有4例(5.41%),部分缓解(PR)有16例(21.62%),病情稳定(SD)有42例(56.76%),病情进展有12例(16.22%),疾病控制率(DCR)为83.78%(62例)。对照组中,总生存时间中位数为12.5个月(范围,8-60个月),无进展生存时间中位数为 9.3 个月(范围,2-40 个月)。CR2 例(3.77%),PR11 例(20.75%),SD 20例(37.74%),疾病进展20例(37.74%),疾病控制率为62.26%(33例)。观察组的疾病控制率明显高于对照组(P<0.05)。主要不良反应为皮肤反应、发热、腹泻、疲劳、皮疹、食欲不振、高血压、脱发、肝功能异常。结论索拉非尼靶向治疗晚期肾癌有较高的疾病控制率,不良反应可控、可耐受。第二部分通过调节自噬水平,增敏肾癌索拉菲尼治疗敏感性背景自噬是溶酶体依赖性降解机制。真核细胞中自噬现象并不少见,通过这种方式促进细胞内蛋白降解,分解细胞浆成分,使其得以循环利用,维护细胞稳态。肿瘤细胞同样存在自噬现象,通过这种方式提高自身耐药性,与肿瘤的生物学特性密切相关。有学者对自噬进行深入研究认为,可以通过作用于自噬相关信号通路从而影响靶向治疗敏感性。通常认为,自噬在肿瘤的发生发展中扮演了双刃剑的角色。当肿瘤在面临化疗或者靶向治疗压力的时候,自噬往往会发挥作用,这是一种调控方式,可以使胞内蛋白分解,胞浆中的某些成分得以释放,细胞可以再次利用这些成分,维护细胞稳态,并使细胞度过能量危机,从而达到逃避治疗的目的。而过度的自噬则会启动细胞的程序性死亡,这种死亡有别于坏死性死亡以及程序性细胞凋亡,其典型特征表现为自噬小体的形成以及自噬相关基因的表达,这种程序性死亡被称作Ⅱ型程序性死亡,也就是说过度的自噬,则可以导致细胞的死亡。乌苯美司是一种常用的抗肿瘤药物,本身属于APN抑制剂,其被广泛应用于临床当中,有效的发挥作用,也受到了学者们的普遍关注,其药理学机制目前处于探索当中。有学者对该药物进行研究,发现其在肾癌中可以发挥有效的抗肿瘤效果,这与其阻断5-LO-LTA4水解酶途径密切相关。我们前期对乌苯美司的作用机制进行研究,将其用于肾癌细胞,发现该药可以诱导后者出现自噬性死亡。由此可见,该药物可以调节肿瘤细胞自噬,对于放疗及靶向治疗具有调节潜力。国外近期研究指出,自噬不仅可以防止受损或不必要成分的积累,还可以回收降解细胞内成分以维持代谢同态性。这个过程中,beclin-1在beclin-l-vps34-vpsl5核心复合物的形成中起着重要作用,这是自噬诱导所必需的。MIR可以调节自噬途径。例如,mir-30a和mir-376b被证明能够抑制beclin-1的活性,从而阻止自噬小泡成核和自噬起始。此外,mir-101是一种有效的自噬抑制剂,尽管它抑制了 rab5a,一种调节早期自噬体形成的小GTP酶。在目前的研究中,我们发现,在一些人的肾细胞癌组织和细胞系中,自噬相关的mir-30a被下调,可能导致beclin-1在肾细胞癌中上调。在有或无化疗药物刺激的癌细胞中发现高水平的自噬激活,参与化疗抵抗。因此,阻断自噬正在成为一种新的策略,以提高化疗对各种癌症的敏感性。例如,Yu等人指出mir-30a介导的自噬抑制能显著增强伊马替尼诱导的人慢性髓系白血病细胞的活性。前期我们证明了索拉非尼对RCC细胞的治疗诱导了自噬激活,这也参与了化疗抵抗。利用药理学或遗传学方法阻断自噬可显著增强索拉非尼对RCC细胞的细胞毒性。氯喹(CQ)是一种增加溶酶体内酸碱度以破坏自噬蛋白降解的溶酶体性药物。已知3-甲基腺嘌呤(3-MA)可阻断LC3B-Ⅰ到LC3B-Ⅱ的转化,并抑制自噬体的形成。B-黄曲霉素A1(BAF-A1)通过抑制自噬体和溶酶体之间的融合来阻止自噬泡的成熟。这些针对自噬不同阶段的不同抑制剂,都增强了索拉非尼对RCC细胞的活性,提示索拉非尼的自噬激活是一种促生存的重要化疗抵抗因子。这一结论得到了BECLIN-1或ATG-5致敏索拉非尼的RNAi沉默在RCC细胞中诱导细胞毒性的事实的进一步支持。综上所述,这些发现表明,RCC中的mir-30a失调可能通过自噬依赖性途径干扰索拉非尼介导的细胞凋亡的有效性,从而代表了 RCC中一个新的潜在治疗靶点。通过结合我们的预试验结果和前期研究者的研究证明,无论是化疗放疗,还是靶向治疗,都有可能导致保护性自噬水平的上调,更多的研究则证明保护性自噬在肿瘤产生耐药性的过程当中起了重要的作用。这充分说明了自噬具有高度的复杂性和背景依赖性。因此充分阐明自噬在肾癌发生发展中的作用,以及在耐药性产生的作用,具有非常重要的意义。此外,我们需要进一步证实乌苯美司这种作用是否与调节自噬水平相关,只有充分认识自噬在肿瘤耐药性当中的作用,才能更好的利用这种药物,辅助肾癌的靶向治疗。目的本文主要研究调节自噬对肾癌细胞索拉菲尼敏感性的影响,通过实验论证的方式探索乌苯美司对于肾癌细胞的影响,该药物可以使其对索拉菲尼敏感性增强。方法(1)梯度加压构建索拉非尼耐药细胞株。IC50论证耐药细胞株的耐药性。观察在不同浓度索拉非尼作用下耐药及非耐药细胞株的活性变化。(2)引入western blot检测不同浓度索拉非尼作用下细胞株的自噬相关指标P62和LC3B等,明确他们的表达情况。(3)观察乌苯美司处理前后耐药细胞株对索拉非尼敏感性变化。(4)检测乌苯美司处理前后耐药细胞株细胞凋亡程度变化。(5)应用乌苯美司处理前后细胞内自噬小体数量有所不同,可以用电镜检测发生的变化,通过上述方式验证自噬。(6)通过上述方式确定所需要的癌细胞株,主要选择对索拉菲尼耐药的植株,用其构建荷瘤小鼠模型。对小鼠进行灌胃处理,分为三组,为索拉菲尼联合乌苯美司组,索拉非尼组及对照组(DMSO)。经过上述步骤后处理小鼠,测量了解肿瘤体积,从而证实乌苯美司同索拉非尼合用能够增强对肿瘤的抑制效果。结果(1)梯度加压构建索拉非尼耐药细胞株成功。IC50验证耐药细胞株具有耐药性。在相同浓度索拉非尼作用下耐药细胞株较非耐药细胞株的具有更高的活性。(2)不同浓度索拉非尼作用下细胞株的自噬相关指标P62和LC3B等出现剂量依赖性变化,浓度越高自噬水平越高,说明索拉非尼可引起瘤细胞自噬水平升高。(3)耐药细胞株对索拉非尼敏感性降低,加用乌苯美司后其敏感性增高。(4)乌苯美司处理前后耐药细胞株细胞凋亡程度明显增加,说明乌苯美司促进耐药细胞株凋亡,从而逆转索拉非尼耐药。(5)应用乌苯美司处理前后细胞内自噬小体数量明显下降,说明乌苯美司有调低瘤细胞自噬的作用。(6)对荷瘤小鼠进行灌胃处理,索拉非尼组较对照组肿瘤体积缩小,而索拉菲尼联合乌苯美司组,肿瘤体积缩小更为明显,从而证实乌苯美司联合索拉菲尼较单用索拉非尼有更好的肿瘤抑制效果。结论(1)肾癌细胞索拉非尼获得性耐药的产生与自噬上调相关。(2)上调肾癌细胞自噬水平,可导致肾癌细胞株对索拉菲尼敏感性下调。(3)使用乌苯美司处理肾癌细胞可导致肾癌细胞内自噬水平降低,恢复耐药肾癌细胞株索拉菲尼敏感性。(4)体内试验进一步证实,乌苯美司与索拉菲尼联合应用可以增强抑制肿瘤的效果,使肿瘤生长受到控制。第三部分Akt信号通路在乌苯美司增强索拉菲尼敏感性及抑制肾癌细胞侵袭性中的作用背景自噬与肿瘤的发生发展密切相关,受到多条信号通路调控,其中Akt通路与之密切相关,同时也影响着索拉菲尼敏感性。虽然已有一些研究调查了细胞对分子靶向药物(包括舒尼替尼)的获得性耐药的分子机制,但对于肾细胞癌(RCC),但这种机制仍然很不清楚。国外研究指出,在舒尼替尼治疗期间维持蛋白激酶活化可能涉及在RCC中获得对舒尼替尼具有抗性的表型,使用靶向活化蛋白激酶治疗可能是克服RCC对舒尼替尼的耐药性有希望的方法。以前的几项研究表明,信号转导通路参与对多种分子靶向药物耐药性的产生。通过研究靶向治疗前后ACHN亚系中主要信号转导途径的状态证实,尽管在治疗前ACHN亚系中磷酸化Akt和MAPK的表达水平没有明显不同,但ACHN/RAkt和MAPK的磷酸化受到了显著抑制;然而,在治疗后,ACHN/R中可检测到Akt和MAPK途径的激活。此外,通过用PI3K特异性抑制剂LY294002进行辅助治疗,可克服ACHN/R细胞对靶向治疗的获得性耐药性。同样,以前的几项研究已经证明了抑制Akt通路对克服各种细胞毒性药物的获得性耐药的潜在作用;例如,彭等人提出,与对顺铂敏感的对照物相比,顺铂耐药细胞表达较高水平的活化Akt,并且Akt或mTOR途径的抑制使这些抗性细胞对顺铂诱导的细胞凋亡敏感。总的来说,这些研究结果表明,在治疗期间Akt信号通路的激活,特别是PI3K/Akt通路,可能与RCC细胞获得该试剂的耐药性表型有关,且有希望通过这些通路的特异性抑制剂来克服。目的探讨Akt信号通路在乌苯美司增强索拉菲尼敏感性及抑制肾癌细胞侵袭性中的作用。方法(1)肾癌细胞Akt信号通路受乌苯美司的影响,经后者处理后其磷酸化水平发生变化,可以引入Weston Blot法检测其影响程度。(2)乌苯美司可以有助于增加肾癌索拉菲尼敏感性,而Akt信号通路在其中发挥作用,可以通过实验论证其过程。Akt激动剂可以作用于肾癌细胞,使Akt信号发生变化,从而起到对其调节作用。乌苯美司和索拉菲尼联合后加入Akt激动剂,观察前者对索拉具有增敏作用的变化,以证实抑制Akt信号可以增强索拉菲尼的正面效果。(3)在肾癌细胞侵袭方面,乌苯美司可以对其产生影响,这一点能够利用Transwell实验加以验证。乌苯美司可以作用于肾癌细胞,使癌细胞的侵袭能力发生变化,再加入Akt激动剂后观察其带来的变化。结果乌苯美司处理肾癌细胞时,观察Akt信号通路变化情况,结果发现其磷酸化水平明显下降。(2)使用Akt激动剂IGF-1(10nM)后,联合应用乌苯美司和索拉菲尼瘤细胞的耐药性有所恢复。故而提示乌苯美司有增加索拉菲尼敏感性的作用,而前者抑制Akt信号通路的功效是发挥上述效果的重要作用机制。(3)对于肾癌细胞的侵袭能力来说,通过Tmnswell实验并未发现索拉菲尼具有明显促进作用,但将其与乌苯美司联合后,肾癌的侵袭能力有所下降,受到一定程度抑制。(4)如果上调肾癌细胞内Akt信号后,将会使瘤细胞侵袭力能力增强,这一过程需要使用Akt激动剂。由此可见乌苯美司具有明确抑制瘤细胞侵袭作用,从而其转移受到抑制,抑制Akt信号在这个过程中发挥重要作用。结论(1)乌苯美司通过增强肾癌细胞索拉菲尼敏感性,而抑制Akt信号通路是达到上述目的的重要机制。(2)肿瘤细胞本身具有侵袭性,联合乌苯美司和索拉菲尼可以产生抑制作用,削弱癌细胞侵犯其他组织能力,其作用与抑制Akt信号通路密切相关。