研究背景及目的鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19是基于海洋生物鲎蓝色血液中的抗内毒素因子(Limulus anti-lipopolysaccharide factor, LALF)核心功能区，经过结构优化改造得到的一条由19个氨基酸残基组成、首尾环化相连的阳离子多肽。我们的前期研究表明CLP-19具有较强的内毒素中和作用。在细胞外环境，它可以直接和内毒素(endotoxin)/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)结合，从而抑制LPS对TLR4受体的激活和促炎细胞因子失控性释放的级联反应。此外，我们还发现提前20h预防性给予CLP-19能最大程度提高致死剂量脓毒症(sepsis)模型小鼠的存活率，减少其体内细菌量和TNF-α的释放量。由于CLP-19在体内半衰期较短(预试验结果显示半衰期仅为0.5h左右)，因此CLP-19可能还通过除直接中和LPS以外的其他机制来发挥抗LPS作用。目前已有其他课题组研究表明：LALF可通过下调炎症蛋白HMGB1的表达来调节免疫系统，因此我们推测来源于LALF的CLP-19可能也具有免疫调节功能。本研究中，我们首先筛选、分析和鉴定了CLP-19在小鼠巨噬细胞中的特异性结合蛋白，随后考察了CLP-19与该蛋白的作用特征和由此产生的免疫调节效应，初步阐明了CLP-19参与免疫调节的主要机制。实验部分第一部分：CLP-19的合成、修饰、结构与活性1.1多肽的制备环状肽CLP-19(CRKPTFRRLKWKIKFKFKC；分子量2511.1Da)和直链肽LL-37(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES；分子量4492.4Da)用分步固相多肽聚合法合成后用三氟乙酸混合溶液洗脱和HPLC纯化。多肽生物素化是将CLP-19、LL-37和生物素在氮气中与DMF、HOBT、PYBOP和DIPEA室温反应2h后经洗脱和纯化所得。CLP-19与FITC相连是通过在吡啶:二甲基甲酰胺:二氯化钾(12:7:5v/v)溶液中反应2h后经洗脱和纯化所得。1.2CLP-19, CLP-19B和CLP-19F结构和生物学特性考察1.2.1CLP-19, CLP-19B和CLP-19F的二级结构考察CLP-19, CLP-19B和CLP-19F(4μM)溶于Tris-HCl缓冲液(10mM, pH7.4)中配置成工作溶液。用POPC和POPG (1:1,1mM)制备脂质体。用0.5cm光程的石英比色池在室温下测定多肽的圆二色谱。1.2.2CLP-19, CLP-19B和CLP-19F对TNF-α释放的影响RAW264.7细胞(1×10~5/孔)接种于96孔板并孵育过夜，加入多肽后在37°C下继续孵育一定时间。用PBS洗去游离药物，加入LPS(100ng/mL)在37°C下孵育4h.收集上清液用ELISA试剂盒测定TNF-α水平。1.2.3CLP-19, CLP-19B和CLP-19F对NF-κB信号通路的影响细胞的前处理过程同上步一致，样品收集后用ELISA试剂盒测定IκB-α的磷酸化水平。1.2.4CLP-19, CLP-19B和CLP-19F直接中和LPS活性系列浓度的多肽与LPS (0.5EU/ml)在37°C下孵育30min，取混合溶液(100μL)与等量的LAL试剂反应后测定浊度。1.2.5CLP-19, CLP-19B and CLP-19F的细胞毒性RAW264.7细胞(1×10~4/孔)接种于96孔板于37°C下孵育2h，加入系列浓度的多肽继续反应4h。之后再与MTT (20μL)孵育4h。弃去培养液加入DMSO (150μL)，用酶标仪测定波长540nm的吸光度。第二部分：CLP-19与RAW264.7细胞特异性结合蛋白的鉴定和作用特征2.1CLP-19结合蛋白的筛选蛋白液与CLP-19B在37°C下孵育30min后与Ultralink Immobilized NeutrAvidin树脂在室温中继续反应1h。清洗树脂除去游离蛋白，加入SDS-PAGE上样缓冲液于沸水浴中反应10min。洗脱蛋白以12.5%SDS-PAGE分离和卡马斯亮蓝染色。2.2CLP-19结合蛋白的鉴定将上部分离所得的CLP-19特异性结合蛋白胶条取出，经洗脱、干燥、酶解、提取和脱水等处理后进行HPLC-MS分析，鉴定出的肽段进行数据库检索。2.3CLP-19结合蛋白的验证Western blotting考察：将蛋白电转至PVDF膜上，用脱脂奶粉在37°C下封闭1h。清洗后与α和β微管蛋白单克隆抗体(1:2000)于4°C下反应过夜，再与HRP标记的二抗(1:5000)在37°C下反应1h，用DAB底物显色。免疫荧光考察：将细胞和CLP-19F (10μg/mL)于37°C下避光孵育1h，清洗后分别用冰冷甲醇和1%BSA固定和封闭。之后再与β微管蛋白单克隆抗体(20μg/mL)、Alexa Fluor555标记二抗(1:500)和DAPI (1:1000)反应，封片后于共聚焦显微镜下观测。2.4CLP-19与微管结合的特性考察2.4.1CLP-19与微管的直接作用纯化微管蛋白重构于普通微管缓冲液，在聚合缓冲液中以35°C反应20min组装成微管后用紫杉醇固定。分别与CLP-19(0.8mg/mL)，微管结合蛋白(MTAPs,包含60%分子量280kDa的MTAP2和40%分子量40~70kDa的tau蛋白质类)和BSA (包含100%分子量68kDa的BSA)在室温下反应30min。各样品置于含紫杉醇的聚合缓冲液上常温100,000×g离心40min。收集上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳分离和卡马斯亮蓝染色。2.4.2CLP-19与微管作用的特异性系列浓度的CLP-19或LL-37与微管蛋白(1μM)反应后再加入CLP-19B (250μM)；并以系列浓度CLP-19B与微管(1μM)或BSA (1mM)共孵育为对照。结合蛋白用SDS-PAGE电泳分离和卡马斯亮蓝染色。2.5离子强度对CLP-19与微管结合的影响微管和CLP-19B在系列浓度的NaCl中反应，结合蛋白用SDS-PAGE电泳分离和卡马斯亮蓝染色。2.6CLP-19与微管结合的生物信息学分析CLP-19的3D结构由Discovery Studio ver2.55软件预测，α和β微管蛋白的异二聚体结构(No.1JFF)源于RCSB蛋白数据库。AutoDock/Vina分子对接软件用于模拟CLP-19与微管的结合，根据能量最小原则生成系列可能的结合模式。PyMOL软件进一步预测了用于键合的功能残基。第三部分：CLP-19与RAW264.7细胞微管蛋白结合发挥免疫调节作用的机制3.1CLP-19对微管动力学平衡的影响游离的α和β微管蛋白亚基分散在4°C微管于缓冲液中，迅速混入37°C预热的CLP-19溶液中使微管终浓度为3mg/mL，CLP-19终浓度为20μM。组装过程在37°C进行60min，之后转换温度至4°C继续反应30min，每5min测定一次波长340nm处的吸光度值。3.2CLP-19对细胞表面TLR4表达的影响贴壁的RAW264.7细胞(5×10~6)与CLP-19(50μg/mL)在37°C下孵育5h，清洗后与LPS(100ng/mL)继续反应4h，以单独LPS、CLP-19处理细胞和药物空白细胞作为对照。反应完成后用冷PBS清洗细胞，1%BSA冰上封闭1h。用TLR4单克隆抗体(1μg/10~6细胞)和Alexa Fluor488标记二抗(1:500)标记细胞表面TLR4蛋白，流式细胞仪检测，设定分析细胞数为20,000个。3.3CLP-19对细胞总TLR4蛋白表达的影响RAW264.7细胞前处理过程同上一步。总蛋白经过分离后用TLR4单克隆抗体(5μg/mL)和α微管蛋白单克隆抗体(1:2000)进行免疫印迹。3.4CLP-19预保护时间与抗LPS效应关系RAW264.7细胞与CLP-19(50μg/mL)孵育系列时间后用LPS (100ng/mL)刺激。细胞表面TLR4表达和TNF-α释放量分别用流式细胞仪和ELISA试剂盒检测。结果第一部分：CLP-19的合成、修饰、结构与活性1.1多肽的制备制备所得多肽CLP-19纯度为98.4%，LL-37为99.1%，CLP-19/biocytin (CLP-19B)为99.6%，LL-37/biocytin (LL-37B)为95.2%以及CLP-19/FITC (CLP-19F)为98.8%。1.2CLP-19, CLP-19B和CLP-19F结构和生物学特性考察1.2.1CLP-19, CLP-19B和CLP-19F的二级结构原二色光谱中CLP-19, CLP-19B和CLP-19F在溶液中都未见明显结构，但是在单层POPC-POPG (1:1)脂质体中出现195nm波峰和210、222nm波谷的α螺旋结构特征峰。1.2.2CLP-19, CLP-19B和CLP-19F对TNF-α释放的影响单独的多肽对细胞的TNF-α释放水平没有显著影响(p>0.05)，而在LPS刺激前给予多肽可明显降低RAW264.7细胞TNF-α释放水平。CLP-19B和CLP-19F显示出与CLP-19类似的效应(p>0.05)。1.2.3CLP-19, CLP-19B和CLP-19F对NF-κB信号通路的影响CLP-19与其衍生物可以诱导IκB-α的磷酸化，但给予预保护剂量的多肽又可抑制LPS刺激的IκB-α磷酸化水平上调。三种多肽药物显示出近似的效应(p>0.05)。1.2.4CLP-19, CLP-19B和CLP-19F对LPS的直接中和作用LAL实验表明三种多肽药物在10到100μM浓度范围内有相似的直接中和LPS作用。1.2.5CLP-19, CLP-19B和CLP-19F对RAW264.7细胞的毒性在不大于100μM浓度范围内的多肽药物对RAW264.7细胞未见明显的细胞毒性(p>0.05)，但进一步增加药物浓度至200μM，出现显著的细胞毒性。三种多肽药物细胞毒性未见明显区别(p>0.05)。第二部分：CLP-19与RAW264.7细胞特异性结合蛋白的鉴定和作用特征2.1CLP-19结合蛋白的筛选与鉴定和CLP-19结合的蛋白分子量主要为50kDa，质谱鉴定该分子量蛋白为α/β微管蛋白。2.2CLP-19结合蛋白的验证免疫印记实验表明CLP-19结合蛋白可以和α/β微管蛋白单克隆抗体反应，在55和50kDa出现条带。免疫荧光显示CLP-19F在胞内可以和微管共定位。2.3CLP-19与微管结合的特征2.3.1CLP-19与微管的直接结合CLP-19样品上清液中出现2.5kDa蛋白条带，而在沉淀中没有，说明单独CLP-19并不能通过离心沉淀下来。CLP-19+微管样品在沉淀中出现2.5kDa蛋白条带而没出现在上清液中，说明CLP-19和微管结合后通过离心被沉淀下来。2.3.2CLP-19与微管结合的特异性微管蛋白与未标记的CLP-19预孵育后可浓度依赖性降低与CLP-19B的结合量。然而预孵育LL-37仅轻微降低了微管与CLP-19B的结合率。同时，CLP-19B与微管的结合率明显高于和BSA的结合率。2.4离子强度对CLP-19和微管结合影响CLP-19与微管在系列NaCl浓度(0~400mM)下孵育，结合量改变不明显，说明离子强度对CLP-19与微管的结合影响不大。2.5CLP-19与微管结合的生物信息学分析计算机模拟分子对接结构表明CLP-19主要结合在α、β微管异二聚体的凹槽位置。第三部分：CLP-19与RAW264.7细胞微管蛋白结合发挥免疫调节作用的机制3.1CLP-19对微管动力学平衡影响CLP-19不仅增加了微管组装的最大速率和聚合量，也消除了组装的成核阶段。此外，CLP-19还可避免微管因为温度降低所致的解聚。3.2CLP-19对细胞表面TLR4表达的影响单独CLP-19对细胞表面TLR4的表达没有影响，但预孵育多肽可显著降低LPS所致的表面TLR4高表达。3.3CLP-19对细胞总TLR4的影响CLP-19作用的细胞总TLR4表达量与药物空白细胞对照无明显区别。3.4CLP-19预保护时间与抗LPS效应的关系CLP-19在预孵育15h范围内可时间依赖性降低LPS所致的TLR4和TNF-α高表达，表明体外最佳预保护时间为15h。结论1. α和β微管蛋白为CLP-19在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的特异性结合蛋白。2. CLP-19作用于微管可干扰其动力学平衡，降低微管依赖性TLR4囊泡运输效率。3. CLP-19可通过降低细胞表面TLR4受体的表达抑制LPS对巨噬细胞的刺激。