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背景与目的干眼病(dry eye disease)又称角结膜干燥症(keratoconjunctivitis sicca)或者泪液功能不全综合征(dysfunctional tear syndrome),是指任何原因引起的泪液质和量的异常或动力学异常,导致泪膜稳定性下降,并伴有眼部不适,导致眼表组织病变为特征的疾病总称,是最常见的眼表疾病。干眼病严重影响患者的生活质量。干眼病发病机制复杂,多种因素均可以导致干眼病。美国眼科研究所干眼病研究小组将干眼病分为泪液生成不足型(包括Sj?gren’s综合症和非Sj?gren’s综合症泪液分泌不足)和泪液蒸发过强型。目前虽然有许多种干眼病模型,但是至今尚无一种动物模型可以准确模仿出该病频繁发生,逐渐恶化,机制复杂的特点。虽然干眼病诱发因素众多,机制复杂,但是该病发生的共同最终通路是泪膜不稳定,泪液中电解质浓度升高导致泪液渗透压升高。泪液的高渗透压是干眼病发病机制中的关键因素。研究表明,正常人泪液渗透压是302±9.7mOsm/L,干眼病患者泪液的渗透压是326.9±22.1mOsm/L。用316mOsm/L作为干眼病的诊断指标,其总体准确度优于其它任何一项干眼病诊断指标。本研究通过用高渗盐水给小鼠点眼,提高泪液的渗透压,制作泪液高渗透压性干眼病模型,观察是否可以引起和干眼病类似的体征和组织病理学损害,初步探讨泪液高渗透压在干眼病发病中的作用。方法1.动物的选择与分组6～8周龄雌性BALB/c小鼠60只,用随机数字表法分为空白组(20只)、对照组(20只)、实验组(20只),双眼取用。对照组采用308mOsm/L氯化钠溶液点眼,每天5次,实验组采用500 mOsm/L氯化钠溶液点眼,每天5次,空白组不点眼。2. SchirmerⅠ实验在裂隙灯显微镜下,用显微镊夹住酚红棉线,置于BALB/c小鼠眼睛的外眦部,60秒后取出,测量酚红棉线湿润的长度。3.角膜荧光素染色和评分使用微量加液器在BALB/c小鼠下方结膜囊内滴入1μl 5%荧光素钠溶液,3分钟后在裂隙灯显微镜下采用钴蓝光检查并照相记录和评分。4.角膜虎红染色使用生理盐水浸湿的虎红试纸,将浸湿的部分轻轻接触BALB/c小鼠的角膜。在裂隙灯显微镜下照相和记录。5.泪液蕨类实验用毛细玻璃管采集BALB/c小鼠下穹隆部泪液,涂在洁净的玻片上,室温干燥,48小时内在光学显微镜下进行蕨类结晶图像分析,并照相记录。6.角膜上皮和结膜上皮的组织学观察采用HE染色在光镜下观察角膜上皮形态,用图像分析软件测量中央角膜上皮厚度。取上方穹窿部结膜,采用PAS染色在光镜下观察上方穹窿部结膜上皮的形态。计算每个高倍视野下结膜杯状细胞的数量。7.扫描电子显微镜观察在第42天,用扫描电子显微镜观察角膜上皮的形态。8.统计学方法采用Kruskal-Wallis H检验比较同一时间点三组BALB/c小鼠的角膜荧光素染色评分。采用Wilcoxon秩和检验比较同一组不同时间点角膜荧光素染色评分。采用完全随机设计资料的方差分析比较同一时间点三组的角膜上皮厚度、泪液分泌量、结膜杯状细胞数量。采用t检验比较同一组不同时间点的角膜上皮厚度,泪液分泌量,结膜杯状细胞数量。结果1. SchirmerⅠ实验第0天,空白组、对照组、实验组的酚红棉线浸湿长度未见统计学差异(P>0.05)。从第7天开始,实验组酚红棉线浸湿长度和第0天比较明显减少(P<0.01)。第7天酚红棉线浸湿长度较第0天下降了28%,第42天较第0天下降66%。2.角膜荧光素染色和评分第0天,空白组、实验组、对照组均有BALB/c小鼠角膜少许点状着色,角膜评分各组未见统计学差异(P>0.05)。实验组BALB/c小鼠随着实验的进行,角膜中央点状着色增加,逐渐出现片状着色,病变累及角膜各个象限,以角膜中央为重。从第7天起,实验组角膜荧光素染色评分和第0天相比明显升高(P<0.01)。实验组第7天角膜荧光素染色评分较第0天升高了75%。3.角膜虎红染色第0天,空白组、实验组、对照组均有3只BALB/c小鼠角膜虎红染色可见少量点状着色。实验组BALB/c小鼠从第7天开始,角膜点状着色逐渐增加,并且出现片状着色,累计角膜4个象限,以中央和鼻侧角膜为重。4.泪液蕨类实验在各个检查时间点,取空白组、对照组、实验组BALB/c小鼠泪液,在光学显微镜下进行泪液蕨类结晶图像分析。空白组、对照组在各个检查时间点均可观察到形态良好的蕨类物形成。实验组BALB/c小鼠泪液结晶中的蕨类物从第7天开始逐渐减少,蕨类物之间的连接中断。第28天以后显微镜下仅能观察到稀少的小蕨类物,甚至完全消失。5.角膜上皮HE染色的光镜观察和角膜上皮厚度测量空白组和对照组BALB/c小鼠角膜HE染色光镜观察可见上皮分层良好,分4～5层,基底部细胞排列呈柱状,靠近角膜表面逐渐变成鳞状上皮细胞。实验组BALB/c小鼠随实验进展基底层细胞部分缺失,上皮细胞分层紊乱,细胞层数减少,出现空泡。第0天和第7天,空白组、对照组、实验组BALB/c小鼠的角膜上皮层厚度未见统计学差异(P>0.05)。从第14天起,实验组较对照组和空白组角膜上皮层厚度明显减少(P <0.05)。6.结膜上皮PAS染色光镜观察和杯状细胞计数空白组和对照组BALB/c小鼠的结膜上皮细胞排列整齐,杯状细胞形态完整,分布在上皮细胞间,主要分布在穹隆部。实验组BALB/c小鼠随实验进展,上皮细胞排列紊乱,甚至出现缺失,杯状细胞形态不一致,数量减少。在第42天部分BALB/c小鼠上方穹隆部杯状细胞完全缺失。7.扫描电子显微镜观察在第42天,用扫描电子显微镜观察空白组、对照组、实验组BALB/c小鼠角膜上皮细胞。可见空白组和对照组上皮细胞形态呈多边形,细胞间紧密连接,细胞表面满布微绒毛。实验组BALB/c小鼠角膜表面微绒毛丢失,角膜表层上皮细胞破坏。结论1.用高渗盐水给BALB/c小鼠点眼可以在小鼠角膜和结膜引起与干眼病患者类似的体征和组织病理学变化。2.用高渗盐水给BALB/c小鼠点眼是一个简单的,可靠,重复性好的模型,这个模型可以运用于干眼病发病机制和药物治疗的研究。3.泪液高渗透压可能在干眼病发病机制中起重要作用。