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本论文旨在通过乳腺上皮细胞及组织培养的体外模型，研究不同蛋氨酸源对猪乳腺蛋白质合成的调控作用及机制，并通过蛋氨酸源转化关键酶活性分布的测定，探讨不同蛋氨酸源在母猪乳腺组织的潜在利用价值。论文共设计四个试验:
试验一猪乳腺上皮细胞原代培养方法的建立
本试验分别采用组织块法和酶消化法对猪乳腺上皮细胞进行原代培养，两者所得到的乳腺上皮细胞细胞均有特征性的角蛋白，并具有典型的乳腺上皮细胞形态学特征，而且，生长良好，至少可以传到十代，第十代细胞同第一代细胞相比形态学并没有差异。
以上结果表明，本试验成功建立了猪乳腺上皮细胞的原代培养技术。
试验二不同蛋氨酸源对猪乳腺上皮细胞蛋白质合成信号通路的调控
本试验以不含有任何蛋氨酸源（负对照）或含有0.6mol/L的其中一种蛋氨酸源[L-蛋氨酸(L-MET)、D-蛋氨酸(D-MET)、DL-2-羟基-4-甲硫基丁酸(HMTBA)、L-MET+D-MET(两者含量比为70∶30)、L-MET+HMTBA（两者含量比为70∶30）]的培养液，对处于蛋氨酸饥饿状态的猪乳腺上皮细胞进行24h培养，采用Real-time PCR的方法测定培养产物中α-S1酪蛋白基因CSN1S1的mRNA表达量，采用Western-blotting方法测定雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体S6激酶1(S6K1)、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)的蛋白表达量，以及它们的磷酸化产物pmTOR、pS6K1和p4EBP1表达量，取得如下
结果:
1)与负对照相比，L-MET组、HMTBA组、L-MET+D-MET组以及L-MET+HMTBA组的α-S1酪蛋白基因CSN1S1均显著(P＜0.05)上调表达，但D-MET组的表达量无显著变化(P＞0.05);2）与负对照相比，L-MET+HMTBA组以及L-MET+D-MET的mTOR和pmTOR的蛋白表达量均显著提高(P＜0.05)，而L-MET组、D-MET组和HMTBA组的mTOR和pmTOR均无显著变化(P＞0.05);3)与负对照相比，L-MET组、HMTBA组、L-MET+D-MET组和L-MET+HMTBA组pS6K1表达量均显著提高，p4EBP1表达量在L-MET组，HMTBA组、L-MET+D-MET组和L-MET+HMTBA组均显著提高（P＜0.05），而D-MET对pS6K1和p4EBP1表达量均无显著影响(P＞0.05)。
以上结果表明，适宜水平的L-MET及其前体物HMTBA对猪乳腺上皮细胞mTOR信号通路有激活作用，并可能促进了乳蛋白的合成。
试验三:不同蛋氨酸源对猪乳腺组织蛋白质合成的调控
在试验二的基础上，本试验以不含任何蛋氨酸源（负对照）或含有0.1mM的L-MET、D-MET、HMTBA或KMB的培养液，对取自泌乳母猪的乳腺组织块进行2h的体外培养，采用稳定同位素(1-13C Phe)标记的方法测定蛋白质合成速率(FSR)，采用Western-blotting方法测定蛋白质合成信号通路相关蛋白(mTOR、S6K1、4EBP1)表达量。主要结果如下:
1)与负对照相比，L-MET组和HMTBA组FSR显著提高(P＜0.05)，KMB组有提高的趋势(P=0.0708)，D-MET组无显著变化（P＞0.05）;2）与负对照相比，L-MET组和HMTBA组mTOR、pmTOR、pS6K1和p4EBP1蛋白表达量均显著提高(P＜0.05)，而D-MET组的以上蛋白表达量均无显著变化(P＞0.05）;3)在2h的培养产物中，与负对照相比，L-MET,HMTBA组和KMB组的蛋氨酸浓度均显著升高(P＜0.05），D-MET组的蛋氨酸无显著变化和提高的趋势(P＞0.05)。
以上结果表明，提高乳腺组织中L-MET和其前体物HMTBA的供给量，均可提高乳腺蛋白质合成的速率，而乳腺蛋白质合成速率的增加与L-MET和HMTBA对mTOR信号通路的激活有关。
试验四:蛋氨酸源转化酶在母猪机体组织中的活性分布研究
为了进一步明确乳腺组织对不同蛋氨酸源的转化和潜在利用能力，本试验分别以D-MET和HMTBA为底物，以KMB的生成量为评价指标，对取自泌乳母猪的肝脏、肾脏、肠道、肌肉和乳腺组织的蛋氨酸源转化酶活性进行了评估。主要结果如下:
1)对于D-MET，肾脏的转化酶活性最高，其次为肝脏和十二指肠，乳腺组织转化酶活性最低，约为肝脏组织的10％;2）对于HMTBA，肝脏的转化酶活性最高，其次为肌肉和脂肪组织，乳腺组织的转化酶活性约为肝脏组织的50％。以上结果表明，母猪机体组织具有充分利用不同蛋氨酸源的生化基础，乳腺组织相对较高的HMTBA转化酶活性和相对较低的D-MET转化酶活性，为mTOR信号通路激活及蛋白质合成速率在不同蛋氨酸源之间的差异提供了进一步的解释。
综合上述，本研究建立了猪乳腺上皮细胞的原代培养方法，发现了不同蛋氨酸源对猪乳腺蛋白质合成速率的差异，证实提高L-MET和其前体物HMTBA的供给量具有促进乳腺蛋白质合成的作用，并揭示其机制与mTOR信号通路的激活以及乳腺组织对蛋氨酸源的转化酶活性有关。
试验一猪乳腺上皮细胞原代培养方法的建立
本试验分别采用组织块法和酶消化法对猪乳腺上皮细胞进行原代培养，两者所得到的乳腺上皮细胞细胞均有特征性的角蛋白，并具有典型的乳腺上皮细胞形态学特征，而且，生长良好，至少可以传到十代，第十代细胞同第一代细胞相比形态学并没有差异。
以上结果表明，本试验成功建立了猪乳腺上皮细胞的原代培养技术。
试验二不同蛋氨酸源对猪乳腺上皮细胞蛋白质合成信号通路的调控
本试验以不含有任何蛋氨酸源（负对照）或含有0.6mol/L的其中一种蛋氨酸源[L-蛋氨酸(L-MET)、D-蛋氨酸(D-MET)、DL-2-羟基-4-甲硫基丁酸(HMTBA)、L-MET+D-MET(两者含量比为70∶30)、L-MET+HMTBA（两者含量比为70∶30）]的培养液，对处于蛋氨酸饥饿状态的猪乳腺上皮细胞进行24h培养，采用Real-time PCR的方法测定培养产物中α-S1酪蛋白基因CSN1S1的mRNA表达量，采用Western-blotting方法测定雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体S6激酶1(S6K1)、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)的蛋白表达量，以及它们的磷酸化产物pmTOR、pS6K1和p4EBP1表达量，取得如下
结果:
1)与负对照相比，L-MET组、HMTBA组、L-MET+D-MET组以及L-MET+HMTBA组的α-S1酪蛋白基因CSN1S1均显著(P＜0.05)上调表达，但D-MET组的表达量无显著变化(P＞0.05);2）与负对照相比，L-MET+HMTBA组以及L-MET+D-MET的mTOR和pmTOR的蛋白表达量均显著提高(P＜0.05)，而L-MET组、D-MET组和HMTBA组的mTOR和pmTOR均无显著变化(P＞0.05);3)与负对照相比，L-MET组、HMTBA组、L-MET+D-MET组和L-MET+HMTBA组pS6K1表达量均显著提高，p4EBP1表达量在L-MET组，HMTBA组、L-MET+D-MET组和L-MET+HMTBA组均显著提高（P＜0.05），而D-MET对pS6K1和p4EBP1表达量均无显著影响(P＞0.05)。
以上结果表明，适宜水平的L-MET及其前体物HMTBA对猪乳腺上皮细胞mTOR信号通路有激活作用，并可能促进了乳蛋白的合成。
试验三:不同蛋氨酸源对猪乳腺组织蛋白质合成的调控
在试验二的基础上，本试验以不含任何蛋氨酸源（负对照）或含有0.1mM的L-MET、D-MET、HMTBA或KMB的培养液，对取自泌乳母猪的乳腺组织块进行2h的体外培养，采用稳定同位素(1-13C Phe)标记的方法测定蛋白质合成速率(FSR)，采用Western-blotting方法测定蛋白质合成信号通路相关蛋白(mTOR、S6K1、4EBP1)表达量。主要结果如下:
1)与负对照相比，L-MET组和HMTBA组FSR显著提高(P＜0.05)，KMB组有提高的趋势(P=0.0708)，D-MET组无显著变化（P＞0.05）;2）与负对照相比，L-MET组和HMTBA组mTOR、pmTOR、pS6K1和p4EBP1蛋白表达量均显著提高(P＜0.05)，而D-MET组的以上蛋白表达量均无显著变化(P＞0.05）;3)在2h的培养产物中，与负对照相比，L-MET,HMTBA组和KMB组的蛋氨酸浓度均显著升高(P＜0.05），D-MET组的蛋氨酸无显著变化和提高的趋势(P＞0.05)。
以上结果表明，提高乳腺组织中L-MET和其前体物HMTBA的供给量，均可提高乳腺蛋白质合成的速率，而乳腺蛋白质合成速率的增加与L-MET和HMTBA对mTOR信号通路的激活有关。
试验四:蛋氨酸源转化酶在母猪机体组织中的活性分布研究
为了进一步明确乳腺组织对不同蛋氨酸源的转化和潜在利用能力，本试验分别以D-MET和HMTBA为底物，以KMB的生成量为评价指标，对取自泌乳母猪的肝脏、肾脏、肠道、肌肉和乳腺组织的蛋氨酸源转化酶活性进行了评估。主要结果如下:
1)对于D-MET，肾脏的转化酶活性最高，其次为肝脏和十二指肠，乳腺组织转化酶活性最低，约为肝脏组织的10％;2）对于HMTBA，肝脏的转化酶活性最高，其次为肌肉和脂肪组织，乳腺组织的转化酶活性约为肝脏组织的50％。以上结果表明，母猪机体组织具有充分利用不同蛋氨酸源的生化基础，乳腺组织相对较高的HMTBA转化酶活性和相对较低的D-MET转化酶活性，为mTOR信号通路激活及蛋白质合成速率在不同蛋氨酸源之间的差异提供了进一步的解释。
综合上述，本研究建立了猪乳腺上皮细胞的原代培养方法，发现了不同蛋氨酸源对猪乳腺蛋白质合成速率的差异，证实提高L-MET和其前体物HMTBA的供给量具有促进乳腺蛋白质合成的作用，并揭示其机制与mTOR信号通路的激活以及乳腺组织对蛋氨酸源的转化酶活性有关。