目标与思路六神曲是由辣蓼、青蒿、杏仁等药与面粉、麦麸混合后经发酵而成的曲类中药,具有消食化积、健脾和胃的作用。临床不仅作为药材广泛使用,而且是很多成药的处方组成,但目前《中国药典》仅在附录收载其定义。继而整理各地中药饮片炮制规范发现,六神曲的研究存在发酵工艺不统一、优势菌种不明确、质量标准待完善等问题。因此,本文从安全性、有效性、质量可控性三方面出发,确定研究思路为:从消化酶和小分子化学成分两个角度出发寻找质控指标,建立质控方法;应用建立的质控方法统一发酵工艺,解释处方组成;确定优势菌种,固定菌种发酵;检测黄曲霉毒素,确保产品安全。最终确立六神曲质量控制关键技术,改善当前仅凭感官和经验进行主观判断的质量控制现状,为后续建立客观的质量评价体系提供参考。内容与方法1、样品收集和制备。样品共分三类,包括48批干燥样品、18批不同发酵阶段的未干燥样品及采用优质原料发酵的43批自制样品。2、基于酶活力为测定指标的质量控制方法研究。从酶种类的选取、紫外分光光度法和高效液相色谱法酶活力测定方法研究、样品酶活力测定几个方面展开,建立准确性、重现性、专属性均优于现有UV法的衍生化-HPLC酶活力测定方法。3、基于小分子化学成分为测定指标的质量控制方法研究。制备发酵前后的六神曲样品各5批,采集样品质谱信息,结合统计分析软件和成分鉴定数据库对发酵前后含量产生变化的成分进行总结。找出其中存在转化关系的成分,并建立通用性强的HPLC法对选择的成分进行含量测定。4、发酵影响因素研究。以糖化酶活力为指标,对原料处理方法、干燥条件、发酵参数、处方组成等发酵影响因素进行考察。基于多元回归分析对各因素影响程度进行排序,结果显示处方组成对发酵影响最大,继而从抑菌性角度展开处方组成探索性研究,尝试对各药材缺少造成糖化酶活力下降的现象进行解释。5、优势菌种鉴别研究。发酵过程中微生物的参与会促进六神曲的发酵,因此统一工艺必须了解其中菌种,也就必须收集未干燥样品,细菌采用MALDI-TOF MS、真菌采用克隆测序技术对发酵过程中的优势菌种进行鉴定并总结优势菌数量变化规律。但临床用六神曲经低温干燥步骤,这可能影响其中微生物种类和数量,导致发酵过程中优势菌与成品中不一致。另外,存留的菌会对人体产生影响,因此有必要了解干燥后微生物种类。采用16SV4区域和ITS1区域扩增子测序分别对干燥样品中细菌、真菌丰度进行分析。6、基于黄曲霉毒素的安全性检测研究。作为天然发酵的曲剂,可能存在黄曲霉毒素污染的情况。采用《中国药典》四部HPLC光化学衍生法测定各样品中黄曲霉毒素含量。结果与结论1、结合文献和预实验结果,糖化酶活力最高且与发酵过程呈现规律变化,因此选定为测定指标。对现有紫外法中涉及的各项酶提取参数进行优化,并建立准确性、重现性、专属性更好的HPLC法测定糖化酶活力。不同厂家糖化酶活力分布在4.20～323.54 U·μmol-1之间,差异较大,表明处方及工艺亟待统一。2、整合PCA、HCA、PLS-DA等统计学方法及Chemspider、OTCML等常见数据库分析结果,发酵后含量上升的成分有123个,包含有机酸类（十八碳烯酸居多）、氨基酸、酯类、酚类、黄酮醇类等;发酵后含量下降的成分有49个,多为酰胺类及糖苷类。整理结果发现,芦丁、金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素之间存在内在成分转化规律,以苷元和三种苷峰面积和的比值作为质量控制指标,建立HPLC法对不同发酵时间自制样品进行测定,发现该指标能客观反映发酵程度。对各厂家样品进行测定,结果与酶活力部分趋势基本一致。3、确定了各发酵影响因素的最佳值,统一了发酵工艺。多元回归分析结果表明处方组成对影响程度最大,探索性研究显示青蒿对革兰氏阴性代表菌大肠杆菌表现出最强抑菌性、辣蓼对革兰氏阳性菌代表菌金黄色葡萄球菌表现出最强抑菌性、苍耳草对真菌代表菌白色念珠菌表现出最强抑菌性,即抑菌性具有选择性,处方中缺一不可。4、菌种可鉴定至种水平,准确度高,结合GB2760-2014食品安全国家标准及微生物计数结果,最终确定米曲霉和米根酶为发酵的优势菌。细菌丰度结果显示干燥后样品也能检测出干燥前优势菌,而真菌干燥前后属水平上基本一致,种水平存在差异,提示可能存在环境污染。该部分研究为实现固定菌种发酵,统一生产工艺提供了理论基础。5、16个厂家干燥样品及3批实验室自制样品黄曲霉毒素测定结果均未超限度,表明安全性较好;同一厂家各样品测定结果差异较小,批间稳定性较好。研究意义与创新点课题以发酵类中药六神曲为研究对象,从酶活力和小分子化学成分两方面出发寻找质量控制指标,首次建立了HPLC法测定六神曲中糖化酶活性的方法和小分子化学成分为指标的质量控制方法。同时,以糖化酶活力为测定指标,对发酵过程影响因素进行考察,统一了处方,规范了制曲工艺中各项参数,另对发酵过程及干燥样品中优势菌种进行鉴别研究,为后续工业大生产中实现固定菌种发酵提供了理论支持;增加了黄曲霉毒素为测定指标的安全性研究。本课题针对六神曲现有质量问题,建立了一系列行之有效的质量控制方法,对于提升六神曲质量水平,推动行业整体向好具有重要意义。本课题首次从安全、有效、质量可控的整体性角度出发,确定六神曲质量控制关键技术。包括基于黄曲霉毒素的安全性检测指标、基于糖化酶活力和小分子化学成分的有效性检测指标,为保证质量可控性,本研究从可能影响质量的各项因素出发,统一了处方,确定了发酵的优势菌种,规范了生产工艺。课题为后续建立标准提供了研究思路和理论依据,对引导行业规范化生产具有重要意义。